Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie

Dit protocol toont aan dat het combineren van sensatieboodschapper-RNA-transactie met impedantiegebaseerde real-time metingen van celmigratie en -invasie de identificatie van genen vergemakkelijkt die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Het op impedantie gebaseerde real-time celanalysesysteem maakt kwantitatieve, continue en uitgebreide monitoring van tumorcelmigratie bij veranderingen in genexpressie mogelijk. Genen die tumoren tot overexpressie brengen en de migratie van tumorcellen stimuleren, kunnen worden geïdentificeerd als potentieel doelwit om metastase bij kankertherapie te remmen.

Voeg om te beginnen 10 microliter 10x reactiebuffer, 1,5 microliter PNE-DNA en 10 microgram plasmide-DNA toe aan een microcentrifugebuis om het plasmide-DNA te lineariseren met het restrictie-enzym. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 100 microliter te brengen. Meng het door erop te tikken en het naar beneden te draaien voordat het reactiemengsel een nacht bij 37 graden Celsius wordt geïncubeerd.

Nogmaals, draai naar beneden en voeg vijf microliter 10% SDS en één microliter van 20 milligram per milliliter RNA-kwaliteit proteïnase K toe aan het reactiemengsel voordat u het mengt en afdraait. Voeg na 30 minuten incubatie bij 50 graden Celsius twee microliters 10x transcriptiebuffer, ATP, GTP, UTP, CTP en T7, en één microgram gelineariseerd DNA toe aan een microcentrifugebuis voor T7 RNA-polymerase-gemedieerde RNA-synthese. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 20 microliter te brengen.

Na een spin-down incubeer je het reactiemengsel gedurende twee uur bij 37 graden Celsius voor RNA-synthese. Draai vervolgens naar beneden en voeg een microliter DNA toe en tik vóór 15 minuten incubatie bij 37 graden Celsius om het sjabloon-DNA te verwijderen. Begin met de lithiumchlorideprecipitatie van het RNA door 10 microliter 7,5 molair lithiumchloride aan het reactiemengsel toe te voegen.

Na het tikken en centrifugeren, incubeer je het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij min 20 graden Celsius. Verwarm het RNA-monster voor het afdekken gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius en plaats het vervolgens op ijs om af te koelen. Voeg vervolgens de componenten van de afdekreactie toe en meng door te tikken.

Draai naar beneden en incubeer het reactiemengsel gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Voor poly-A-residu draait u het monster naar beneden en voegt u de poly-A-residureactiecomponenten toe. Tik vervolgens op, draai naar beneden en incubeer het reactiemengsel gedurende twee uur bij 37 graden Celsius.

Voor lithiumchlorideprecipitatie en kwantificering van het synthetische mRNA voegt u 50 microliter 7,5 molair lithiumchloride toe en voert u de lithiumchlorideprecipitatie uit. Haal een hoeveelheid ECM-gelbouillon uit de vriezer en bewaar deze op ijs. Verdun de 10 milligram per liter ECM-gel tot een werkconcentratie door 990 microliter DMEM te mengen met 10 microliter ECM-gel in een microcentrifugebuisje.

Meng door voorzichtig pipetteren. Voeg 60 microliter verdunde ECM-gel toe aan elk van de 16 putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Plaats de bovenste kamer van de CIM-plaat met het plaatdeksel eraf op een beschermend plastic vel in een kooldioxide-incubator gedurende ongeveer vier uur om een gellaag te vormen.

Voeg voor elektroporatie één milliliter DPBS toe aan de tumorcelsuspensie in elke buis. Tik op de celophanging en draai drie keer gedurende 10 seconden naar beneden. Verwijder het supernatans met behulp van een micropipet.

Voeg 110 microliter resuspensiebuffer R toe aan de celpellet om 0,1 miljoen cellen in 10 microliter te verkrijgen. Voeg synthetisch mRNA toe aan de celkorrel om de concentratie van 0,2 tot 20 nanogram per microliter te verkrijgen, afhankelijk van het gewenste expressieniveau. Meng en resuspendeer de celpellet voorzichtig door te tikken.

Elektropoleren vervolgens 10 microliter van de celsuspensie met een elektroporatiesysteem op 1.350 volt gedurende 10 milliseconden met telkens drie pulsen. Als u klaar bent, brengt u de geëlektropoleerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met 1,1 milliliter DMEM die 0,5% FBS bevat. Open het analyseprogramma door te dubbelklikken op het pictogram van de real-time celanalysesoftware.

Nadat u de standaardoptie voor het instellen van het experimentpatroon hebt geopend, selecteert u de optie om drie experimenten afzonderlijk uit te voeren. Open elke houder door op het tabblad met nummers te klikken. Klik vervolgens op het tabblad Experimentnotities.

Selecteer de map en sla de gegevens op door de naam van het experiment in te voeren. Klik op het tabblad Lay-out en selecteer vier putjes tegelijk om de vier dubbele putjes voor elke behandelingsaandoening in te stellen. Voer de voorbeeldinformatie in en klik op toepassen.

Klik op het tabblad schema en voeg vervolgens een stap toe om de tweestapsmodus van de celimpedantiemetingen in te stellen. Klik vervolgens op toepassen om de eerste stap in te stellen. Klik nogmaals op voeg een stap toe en voer 10 minuten in voor het interval en 48 uur voor de duur van migratie en invasie.

Klik vervolgens op toepassen om de tweede stap in te stellen. Voeg een uur voor de celimpedantiemeting 160 microliter DMEM met 10% serum of andere chemolokstoffen toe aan de putjes van de onderste kamer van de CIM-plaat. Monteer de bovenste kamer met de ECM-gelgecoate putten voor invasie of ongecoate putten voor migratie met de onderste kamer.

Voeg voor de celmigratietest 50 microliter laag serummedium toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Plaats de CIM-plaat en de houder van het systeem in de CO2-incubator. Klik op het tabblad Bericht.

Zodra de verbinding in orde is, wordt het bericht weergegeven, de CIM-plaat is klaar voor het experiment. Pre-incubeer de geassembleerde CIM-plaat in de kooldioxide-incubator gedurende 30 tot 60 minuten vóór de real-time celanalyse om de CIM-plaat te laten wennen aan de kweekconditie. Voor de basismeting klikt u op de startknop voor elke houder.

Wanneer het venster Opslaan als wordt weergegeven, slaat u het experimentele bestand op om de basislijnmeting uit te voeren. Voor het plaatsen van cellen verwijdert u de CIM-plaat uit de houder en plaatst u deze in de bioveiligheidskast op de plaathouder. Voeg vervolgens 100 microliter geëlektropoleerde cellen met 100.000 cellen toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat en laat de CIM-plaat 30 minuten onder de bioveiligheidskast bij kamertemperatuur staan.

Meet de celimpedantie door de volledig geassembleerde CIM-plaat terug te plaatsen in de betreffende houder. Begin de celimpedantiemeting voor de tweede stap door op de startknop van de wieg en op het tabblad Plot te klikken. Klik vervolgens op de knop Alles toevoegen en selecteer de vakjes Gemiddelde en standaarddeviatie om de gegevens in realtime te visualiseren.

De elektroporatie van U 118 mg glioblastoomcellen met verschillende concentraties synthetisch crack één mRNA resulteerde in een concentratie-afhankelijke toename van flag tagged crack one-eiwit één dag na transfectie. 0,2 en twee nanogram per microliter mRNA leidden tot een niet-detecteerbare of bescheiden expressie van het exogene crack one-eiwit. 20 nanogram per microliter mRNA resulteerde in een hoger expressieniveau dan het endogene crack one-eiwit.

De celmigratietest gaf aan dat de elektroporatie 0,2 of twee nanogram per microliter was, één mRNA had geen grote invloed op de celmigratie. Elektroporatie met 20 nanogram per microliter crack één mRNA leidde echter tot een duidelijke stimulatie van celmigratie, waarbij meer cellen migreerden tussen twee en 13 uur, waaruit bleek dat glioblastoomcelmigratie werd gestimuleerd door de toename van het crack één-eiwitniveau. De elektroporatie met synthetisch crack L-mRNA leidde een dag na transfectie tot een robuuste expressie van flag tagged crack L-eiwit.

De invasie van de controlecellen vertraagde met de verhoogde ECM-eiwitconcentratie. Crack L-cellen die te veel tot expressie brengen, vertoonden een ECM-gelconcentratie-afhankelijke afname van celinvasie. De vergelijking tussen de controlegroep en de cellen die over de huid van crack L tot expressie komen bij verschillende ECM-gelconcentraties, gaf aan dat overexpressie van crack L over het algemeen de celinvasie door de ECM-gellaag stimuleerde.

De resultaten suggereerden ook dat de twee celpopulaties differentieel werden beïnvloed door het verhogen van de ECM-gelconcentratie op verschillende tijdstippen. Cellen moeten snel, voorzichtig en volledig worden geresuspendeerd in de geresuspendeerde bubbel R mensen elektroporatie omdat lange incubatie van cellen in de geresuspendeerde bubbel R cellen ongezond maakt. Snel en langzaam migrerende tumorcellen kunnen worden geïsoleerd om verschillen tussen de twee celpopulaties te karakteriseren.