Misurazione quantitativa in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali in seguito alla trasfezione sintetica di mRNA

Questo protocollo dimostra che la combinazione della transazione dell’RNA messaggero della sensazione con le misurazioni in tempo reale della migrazione e dell’invasione cellulare basate sull’impedenza facilita l’identificazione dei geni che stimolano la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale basato sull’impedenza consente un monitoraggio quantitativo, continuo e completo della migrazione delle cellule tumorali in seguito alle variazioni dell’espressione genica. I geni che sovraesprimono i tumori e stimolano la migrazione delle cellule tumorali possono essere identificati come potenziali bersagli per inibire le metastasi nella terapia del cancro.

Per iniziare, aggiungere 10 microlitri di tampone di reazione 10x, 1,5 microlitri di PNE one e 10 microgrammi di DNA plasmidico a una provetta da microcentrifuga per linearizzare il DNA plasmidico con l’enzima di restrizione. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 100 microlitri. Mescolalo picchiettando e girandolo prima di incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius durante la notte.

Ancora una volta, centrifugare e aggiungere cinque microlitri di SDS al 10% e un microlitro di 20 milligrammi per millilitro di proteinasi K di grado RNA alla miscela di reazione prima di mescolarla e centrifugarla. Dopo 30 minuti di incubazione a 50 gradi Celsius, aggiungere due microlitri ciascuno di tampone di trascrizione 10x, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e un microgrammo di DNA linearizzato a una micro provetta da centrifuga per la sintesi dell’RNA mediata da RNA T7 polimerasi. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 20 microlitri.

Dopo una centrifuga, incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore per la sintesi dell’RNA. Successivamente, centrifugare e aggiungere un microlitro di DNA e picchiettare prima di 15 minuti di incubazione a 37 gradi Celsius per rimuovere il DNA stampo. Iniziare la precipitazione del cloruro di litio dell’RNA aggiungendo 10 microlitri di cloruro di litio 7.5 molari alla miscela di reazione.

Dopo aver picchiettato e centrifugato, incubare la miscela di reazione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Per il tappo, riscaldare il campione di RNA a 65 gradi Celsius per 10 minuti e poi metterlo su ghiaccio per il raffreddamento. Successivamente, aggiungere i componenti di reazione di tappatura e miscelare picchiettando.

Centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per un’ora. Per la coda di poli-A, ruotare il campione e aggiungere i componenti di reazione di coda di poli-A. Quindi picchiettare, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore.

Per la precipitazione del cloruro di litio e la quantificazione dell’mRNA sintetico, aggiungere 50 microlitri di cloruro di litio 7,5 molari ed eseguire la precipitazione del cloruro di litio. Rimuovere un’aliquota di gel ECM dal congelatore e conservarla in ghiaccio. Diluire i 10 milligrammi per litro di gel ECM a una concentrazione di lavoro mescolando 990 microlitri di DMEM con 10 microlitri di gel ECM in una micro provetta da centrifuga.

Miscelare con pipettaggio delicato. Aggiungere 60 microlitri di gel ECM diluito a ciascuno dei 16 pozzetti della camera superiore della piastra CIM. Posizionare la camera superiore della piastra CIM con il coperchio della piastra su un foglio di plastica protettiva all’interno di un incubatore ad anidride carbonica per circa quattro ore per formare uno strato di gel.

Per l’elettroporazione, aggiungere un millilitro di DPBS alla sospensione delle cellule tumorali in ciascuna provetta. Tocca la sospensione cellulare e gira verso il basso tre volte per 10 secondi. Rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta.

Aggiungere 110 microlitri di tampone di risospensione R al pellet cellulare per ottenere 0,1 milioni di cellule in 10 microlitri. Aggiungere mRNA sintetico al pellet cellulare per ottenere la concentrazione da 0,2 a 20 nanogrammi per microlitro a seconda del livello di espressione desiderato. Mescolare e risospendere delicatamente il pellet cellulare picchiettando.

Successivamente, elettropolizzare 10 microlitri di sospensione cellulare con un sistema di elettroporazione a 1, 350 volt per 10 millisecondi con tre impulsi ogni volta. Una volta fatto, trasferire le celle elettroporate in una nuova provetta da microcentrifuga con 1,1 millilitri di DMEM contenente lo 0,5% di FBS. Aprire il programma di analisi facendo doppio clic sull’icona del software di analisi cellulare in tempo reale.

Dopo aver aperto l’opzione di impostazione predefinita del modello di esperimento, selezionare l’opzione per eseguire tre esperimenti separatamente. Aprire ogni base facendo clic sulla scheda del numero. Quindi, fai clic sulla scheda Note dell’esperimento.

Seleziona la cartella e salva i dati inserendo il nome dell’esperimento. Fare clic sulla scheda layout e selezionare quattro pozzetti alla volta per impostare i quattro pozzetti duplicati per ciascuna condizione di trattamento. Inserisci le informazioni del campione e fai clic su Applica.

Fare clic sulla scheda Pianificazione, quindi aggiungere un passaggio per impostare la modalità a due fasi delle misurazioni dell’impedenza della cella. Quindi, fai clic su Applica per impostare il primo passaggio. Fai di nuovo clic su aggiungi un passaggio e inserisci 10 minuti per l’intervallo e 48 ore per la durata della migrazione e dell’invasione.

Quindi, fai clic su Applica per impostare il secondo passaggio. Un’ora prima della misurazione dell’impedenza cellulare, aggiungere 160 microlitri di DMEM contenente il 10% di siero o altri attrattivi chemioterapici nei pozzetti della camera inferiore della piastra CIM. Assemblare la camera superiore contenente i pozzetti rivestiti in gel ECM per l’invasione o i pozzetti non rivestiti per la migrazione con la camera inferiore.

Per il saggio di migrazione cellulare, aggiungere 50 microlitri di terreno sierico a basso contenuto di terreno ai pozzetti della camera superiore della piastra CIM. Posizionare la piastra CIM e la culla del sistema nell’incubatore a CO2. Fare clic sulla scheda del messaggio.

Una volta che la connessione è corretta, viene visualizzato il messaggio, la piastra CIM è pronta per l’esperimento. Pre-incubare la piastra CIM assemblata nell’incubatore ad anidride carbonica per 30-60 minuti prima dell’analisi cellulare in tempo reale per acclimatare la piastra CIM alle condizioni di coltura. Per la lettura della linea di base, fare clic sul pulsante di avvio per ciascuna base.

Quando viene visualizzata la finestra Salva con nome, salvare il file sperimentale per eseguire la lettura della linea di base. Per l’alloggiamento delle celle, rimuovere la piastra CIM dalla culla e posizionarla nell’armadio di biosicurezza sul supporto della piastra. Quindi aggiungere 100 microlitri di celle elettroporate contenenti 100.000 cellule nei pozzetti della camera superiore della piastra CIM e lasciare la piastra CIM sotto l’armadio di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente.

Misurare l’impedenza della cella riportando la piastra CIM completamente assemblata nella rispettiva base. Iniziare la misurazione dell’impedenza della cella per il secondo passaggio facendo clic sul pulsante di avvio della base e sulla scheda del grafico. Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi tutto e selezionare le caselle media e deviazione standard per visualizzare i dati in tempo reale.

L’elettroporazione di cellule di glioblastoma U 118 mg con concentrazioni variabili di mRNA di crack sintetico ha provocato un aumento dipendente dalla concentrazione della proteina di crack one marcata con flag un giorno dopo la trasfezione. 0,2 e due nanogrammi per microlitro di mRNA hanno portato a un’espressione non rilevabile o modesta della proteina esogena crack one. 20 nanogrammi per microlitro di mRNA hanno determinato un livello di espressione più elevato rispetto alla proteina endogena crack one.

Il test di migrazione cellulare ha indicato che l’elettroporazione era di 0,2 o due nanogrammi per microlitro di crack, un mRNA non ha influenzato notevolmente la migrazione cellulare. Tuttavia, l’elettroporazione con 20 nanogrammi per microlitro di mRNA ha portato a una chiara stimolazione della migrazione cellulare con più cellule che migrano tra due e 13 ore, rivelando che la migrazione delle cellule di glioblastoma è stata stimolata dall’aumento del livello della proteina del crack uno. L’elettroporazione con mRNA sintetico della cricca L ha portato ad una robusta espressione della proteina L della cricca marcata con bandiera un giorno dopo la trasfezione.

L’invasione delle cellule di controllo è rallentata con l’aumento della concentrazione di proteina ECM. Il crack L sulle cellule esprimenti ha mostrato una diminuzione dipendente dalla concentrazione del gel ECM nell’invasione cellulare. Il confronto tra le cellule di controllo e quelle che sovraesprimono la fessura L a diverse concentrazioni di gel ECM ha indicato che la sovraespressione della fessura L ha generalmente stimolato l’invasione cellulare attraverso lo strato di gel ECM.

I risultati hanno anche suggerito che le due popolazioni cellulari sono state influenzate in modo differenziato dall’aumento della concentrazione di gel ECM in diversi punti temporali. Le cellule devono essere risospese rapidamente, delicatamente e completamente nell’elettroporazione delle persone con bolla R risospesa perché la lunga incubazione delle cellule nella bolla risospesa R rende le cellule malsane. Le cellule tumorali a migrazione rapida e lenta possono essere isolate per caratterizzare le differenze tra le due popolazioni cellulari.