合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

このプロトコルはインピーダンスと感覚のメッセンジャーRNAトランザクションを結合し、細胞移動および浸潤のインピーダンスによって基づく実時間測定が腫瘍細胞の移動および侵入を刺激する遺伝子の同一証明を促進することを示す。インピーダンスベースのリアルタイム細胞解析システムは、遺伝子発現変化時の腫瘍細胞の移動を定量的、連続的、包括的にモニタリングすることができます。腫瘍を過剰発現させ、腫瘍細胞の遊走を刺激する遺伝子は、がん治療における転移を阻害する潜在的な標的として特定できます。

まず、10x反応バッファー10マイクロリットル、PNE 1.5マイクロリットル、プラスミドDNA10マイクログラムをマイクロ遠心チューブに加え、プラスミドDNAを制限酵素で直鎖化します。ヌクレアーゼ遊離水を加えて、反応量を100マイクロリットルにします。反応混合物を摂氏37度で一晩インキュベートする前に、軽く叩いて回転させて混合します。

ここでも、10%SDSを5マイクロリットル、RNAグレードのプロテイナーゼKを1ミリリットルあたり1マイクロリットル、1マイクロリットルの20ミリグラムを反応混合物にスピンダウンして加え、その後、混合してスピンダウンします。摂氏50度で30分間インキュベートした後、10倍転写バッファー、ATP、GTP、UTP、CTP、およびT7をそれぞれ2マイクロリットル、および1マイクログラムの直鎖状DNAをマイクロ遠心チューブに加え、T7 RNAポリメラーゼを介したRNA合成を行います。ヌクレアーゼフリー水を加えて、反応量を20マイクロリットルにします。

スピンダウン後、反応混合物を摂氏37度で2時間インキュベートし、RNA合成を行います。次に、スピンダウンして1マイクロリットルのDNAを加え、37°Cで15分間インキュベートする前にタップしてテンプレートDNAを除去します。反応混合物に10マイクロリットルの7.5モル塩化リチウムを添加することにより、RNAの塩化リチウム沈殿を開始します。

タップしてスピンダウンした後、反応混合物を摂氏マイナス20度で30分間インキュベートします。キャッピングには、RNAサンプルを摂氏65度で10分間加熱し、氷上に置いて冷却します。次に、キャッピング反応成分を添加し、タッピングして混合します。

反応混合物をスピンダウンし、摂氏37度で1時間インキュベートします。ポリAテーリングの場合は、サンプルをスピンダウンし、ポリAテーリング反応成分を添加します。次に、反応混合物をタップし、スピンダウンし、摂氏37度で2時間インキュベートします。

塩化リチウムの沈殿および合成mRNAの定量のために、50マイクロリットルの7.5モルの塩化リチウムを添加し、塩化リチウム沈殿を行う。ECMゲルストックのアリコートを冷凍庫から取り出し、氷上に保管します。マイクロ遠心チューブ内で990マイクロリットルのDMEMと10マイクロリットルのECMゲルを混合することにより、1リットルあたり10ミリグラムのECMゲルを使用濃度に希釈します。

穏やかなピペッティングで混合します。60マイクロリットルの希釈ECMゲルを、CIMプレートの上部チャンバーの16ウェルのそれぞれに添加します。プレートカバーを外した状態でCIMプレートの上部チャンバーを、二酸化炭素インキュベーター内の保護用プラスチックシートの上に約4時間置き、ゲル層を形成します。

エレクトロポレーションでは、各チューブの腫瘍細胞懸濁液に1ミリリットルのDPBSを加えます。細胞懸濁液をタップし、10秒間3回スピンダウンします。マイクロピペットを使用して上清を取り除きます。

110マイクロリットルの再懸濁バッファーRを細胞ペレットに添加し、10マイクロリットルで10万個の細胞を得る。合成mRNAを細胞ペレットに添加して、所望の発現レベルに応じてマイクロリットルあたり0.2〜20ナノグラムの濃度を得る。細胞ペレットを混合し、軽く叩いて再懸濁します。

次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液をエレクトロポレーションシステムで1, 350ボルトで10ミリ秒間、毎回3パルスでエレクトロポレーションします。完了したら、エレクトロポレーションした細胞を、0.5%FBSを含む1.1ミリリットルのDMEMが入った新しいマイクロ遠心チューブに移します。リアルタイム細胞解析ソフトウェアのアイコンをダブルクリックして解析プログラムを開きます。

既定の実験パターン設定オプションを開いた後、3 つの実験を個別に実行するオプションを選択します。番号タブをクリックして、各クレードルを開きます。次に、[実験ノート] タブをクリックします。

フォルダーを選択し、実験の名前を入力してデータを保存します。レイアウトタブをクリックし、一度に4つのウェルを選択して、各処理条件のクワッド重複ウェルを設定します。サンプル情報を入力し、[適用]をクリックします。

スケジュールタブをクリックし、ステップを追加して、セルインピーダンス測定の2ステップモードを設定します。次に、「適用」をクリックして最初のステップを設定します。もう一度 [ステップの追加] をクリックし、間隔に 10 分、移行と侵入の期間に 48 時間を入力します。

次に、「適用」をクリックして、2番目のステップを設定します。細胞インピーダンス測定の1時間前に、10%血清またはその他の化学療法誘引物質を含む160マイクロリットルのDMEMをCIMプレートの下部チャンバーのウェルに添加します。ECMゲルでコーティングされた侵入用のウェル、または移動用のコーティングされていないウェルを含む上部チャンバーを下部チャンバーで組み立てます。

細胞遊走アッセイでは、50マイクロリットルの低血清培地をCIMプレートの上部チャンバーのウェルに添加します。CIM プレートとシステムのクレードルを CO2 インキュベーターに入れます。「メッセージ」タブをクリックします。

接続に問題がなければ、CIMプレートは実験の準備が整いました。組み立てたCIMプレートを二酸化炭素インキュベーターで30〜60分間プレインキュベートしてから、リアルタイム細胞解析を行い、CIMプレートを培養条件に順応させます。ベースラインの読み取りについては、各クレードルのスタートボタンをクリックします。

[名前を付けて保存]ウィンドウが表示されたら、実験ファイルを保存してベースラインの読み取りを実行します。セルを装着する場合は、クレードルからCIMプレートを取り外し、プレートホルダーのバイオセーフティキャビネットに置きます。次に、100 、 000 個の細胞を含む 100 マイクロリットルのエレクトロポレーションセルを CIM プレートの上部チャンバーのウェルに追加し、CIM プレートを室温で 30 分間バイオセーフティキャビネットの下に置いておきます。

完全に組み立てられたCIMプレートをそれぞれのクレードルに戻して、セルインピーダンスを測定します。2番目のステップのセルインピーダンス測定は、クレードルスタートボタンとプロットタブをクリックして開始します。次に、[すべて追加] ボタンをクリックし、平均ボックスと標準偏差ボックスを選択して、データをリアルタイムで視覚化します。

さまざまな濃度の合成クラック1 mRNAを用いたU 118 mg神経膠芽腫細胞のエレクトロポレーションにより、トランスフェクションの翌日にフラグタグ付きクラック1タンパク質の濃度依存的な増加が見られました。マイクロリットルあたり0.2ナノグラムと2ナノグラムのmRNAは、外因性の亀裂1タンパク質の検出不能または控えめな発現をもたらした。マイクロリットルあたり20ナノグラムのmRNAは、内因性のクラックワンタンパク質よりも高い発現レベルをもたらしました。

細胞遊走アッセイは、エレクトロポレーションが0.2または2ナノグラム/マイクロリットルの亀裂であり、1つのmRNAが細胞遊走に大きな影響を与えないことを示しました。しかし、1マイクロリットルあたり20ナノグラムの亀裂1 mRNAによるエレクトロポレーションは、2時間から13時間の間により多くの細胞が移動する細胞移動の明らかな刺激をもたらし、神経膠芽腫細胞の移動が亀裂1タンパク質レベルの増加によって刺激されたことが明らかになりました。合成クラックL mRNAによるエレクトロポレーションにより、トランスフェクションの1日後にフラグタグ付きクラックLタンパク質が強固に発現しました。

コントロール細胞への浸潤は、ECMタンパク質濃度の上昇とともに遅くなりました。クラックLを過剰発現する細胞は、細胞浸潤におけるECMゲル濃度依存的な減少を示しました。異なるECMゲル濃度でのコントロール細胞とクラックL過剰発現細胞の比較は、クラックLの過剰発現が一般的にECMゲル層を通る細胞浸潤を刺激することを示しました。

また、この結果は、2つの細胞集団が、異なる時点でECMゲル濃度を増加させることによって異なる影響を受けることを示唆しています。再懸濁された気泡Rでの細胞の長時間のインキュベートは細胞を不健康にするため、細胞は再懸濁された気泡Rの人のエレクトロポレーションに素早く、穏やかに、そして完全に再懸濁されるべきです。高速および低速の遊走腫瘍細胞を単離して、2つの細胞集団間の違いを特徴付けることができます。