A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyse av sultindusert autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme
Chapters
Summary August 4th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver induksjon av autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme via næringsutarming og analyserer endringer i autofagi ved bruk av transgene fluestammer.
Transcript
Denne protokollen beskriver hvordan man induserer autofagi i Drosophila melanogaster larvefettlegeme via aminosyreuttømming og hvordan man analyserer forskjellene i autofagi blant mutante kloner. Siden autofagi er svært følsom for ernæringstilgjengelighet under dyrkningsbetingelser, har klonal analyse, en metode som analyserer mutante celler versus villtypeceller i samme vev, en fordel i å dissekere autofagidefekter. Begynn med å introdusere tre hanner og 15 kvinnelige voksne fluer i et hetteglass med standard maismel eller melasse eller agar Drosophila media ved 25 grader Celsius for parring.
48 timer etter induksjon, knips på hetteglasset med parring til fluene er bedøvet og slipp ned på mediet nederst i hetteglasset. Trekk ut parringshetteglasset og dekk munnen med et omvendt hetteglass med nye medier. Snu og bank deretter på hetteglassene for å overføre fluene til det ferske hetteglasset.
Plugg hetteglasset med fersk kultur og kast det gamle hetteglasset. Plasser hetteglasset med fersk kultur i en 25 graders Celsius-inkubator for egglegging på ferske medier. Fjern fluene etter seks timers egglegging og kast fluene ved å dumpe dem i en kolbe som inneholder 75% etanol.
Inkuber hetteglasset med embryoer i et 37 graders vannbad i en time for å indusere flippase-uttrykk. Deretter plasserer du dem i en 25 graders Celsius-inkubator og lar embryoene fortsette å utvikle seg. Bruk en laboratoriespatel, øs ut mediet som inneholder de utviklende larver i en petriskål 75 timer etter egglegging.
Tilsett 1X PBS i fatet og skill forsiktig ut kulturmediet og larvene med lange tang. Velg deretter 10 til 15 tidlige tredje instar larver. Fyll brønnene på en ni-brønns glassforsenkningspunktplate med 1X PBS og plasser de separerte tredje instarlarvene i brønnene ved hjelp av lange tang.
Vask larvene grundig for å fjerne alle medierester. Ta fem milliliter 20% sukroseoppløsning i et tomt hetteglass og legg de rene tredje instar larver i denne løsningen ved hjelp av lange tang. Inkuber dette hetteglasset i en 25 graders Celsius-inkubator i seks timer før du høster dem for disseksjon.
Tilsett 1X PBS i hver brønn på den ni-brønns glassforsenkningspunktplaten og overfør larvene inn i brønnene med lange tang. Plasser en larve i en brønn med dorsalsiden vendt oppover. Ta tak i larvens kutikula med to 5 tang midt på larvestammen og riv forsiktig opp neglebåndene.
De eksponerte fettlegemene, sammen med andre larvevev, vil fortsatt være festet til larvens. Trekk nok til å eksponere de indre organene så mye som mulig. Gjenta dette trinnet for alle larver.
Overfør larvekroppen til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør inneholdende 500 mikroliter 4% PFA og inkuber i 30 minutter ved 25 grader Celsius uten å riste rørene. Etter 30 minutter pipetterer du ut PFA-oppløsningen. Tilsett 500 mikroliter 1X PBS i røret.
Rist røret forsiktig på en flat rotator i 10 minutter og kast deretter 1X PBS-oppløsningen. Gjenta dette tre ganger. Bruk lange tanger til å overføre det faste og vaskede larvekadaveret til en brønn i den ni forsenkningspunktplaten fylt med 1X PBS.
Fjern alt ikke-fett kroppsvev med 5 tang. Til slutt monterer du bitene av fettlegemet på et mikroskopglass med 80% glyserol som monteringsmedium og legger et deksel på toppen. Mutant en og mutant to er to uavhengige dødelige mutanter på X-kromosomet og isogeniserte gulhvite FRT 19A-fluer fungerer som en kontroll her.
GFP-Atg8a-mønstre ble analysert i kontroll-, mutante en- eller mutant-to mosaikklarvefettlegemer, og de mutante klonene eller kontrollklonene ble negativt markert med RFP. I kontrollklonene var mønstrene til GFP-Atg8a Puncta lik de i de omkringliggende RFP-positive cellene. I mutante en mutant kloner ble GFP-Atg8a Puncta sterkt redusert.
Og i mutante to mutante kloner ble antallet og størrelsen på GFP-Atg8a Puncta økt. Larvenes utviklingsstadium er kritisk her. Tiden for utvikling og varigheten av sult må endres i henhold til hvert laboratoriums kulturmediumoppskrifter.
Denne prosedyren kan brukes til å utforske selektiv autofagi. For eksempel kan mitofagi overvåkes i fluefettlegemer ved å feste et fluorescerende protein til en mitokondriell målrettingssekvens.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
