Biology
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम पर लागू 96-वेल प्लेट प्रारूप में फास्ट कॉलोनी बनाने वाली इकाई गिनती
Chapters
Summary January 13th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
यह विधि प्लेट कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के लिए 96-वेल प्लेट प्रारूप का उपयोग करके माइक्रोबियल बहुतायत को निर्धारित करती है और पूरे फ्लाई होमोजेनेट नमूनों में ड्रोसोफिला माइक्रोबायोम पर लागू होती है। सीएफयू को यहां प्रदान किए गए एक स्वचालित छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ गिना जाता है।
Transcript
कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों, या सीएफयू की गिनती, माइक्रोबायोलॉजी में एक मानक तकनीक है, लेकिन यह धीमी है और इसके लिए बहुत सारी आगर प्लेटों की आवश्यकता होती है। हमारी तकनीक दोनों समय एगर प्लेटों में पारंपरिक सीएफयू गिनती विधियों पर सौ गुना लाभ प्रदान करती है। हमने छोटे पशु मॉडल, विशेष रूप से फल मक्खियों के आंत माइक्रोबायोम को मापने के लिए पद्धति लागू की है।
यह प्रोटोकॉल जीनोबायोटिक्स मक्खियों में सीएफयू की मात्रा निर्धारित करने का एक सरल, तेज़ और स्वचालित तरीका है। यह प्रोटोकॉल सीएफयू की तस्वीर लेने के लिए DIY-निर्मित इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ एक वर्कफ़्लो प्रदान करता है और उन्हें गिनने के लिए कस्टम सॉफ़्टवेयर प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी माइक्रोबायोलॉजी प्रयोग में किया जा सकता है जहां चढ़ाना और सीएफयू गिनती के अधिक कुशल तरीके उपयोगी हो सकते हैं।
मक्खियों को कुशलता से संभालने और प्लेटों को स्पॉट करने के लिए मैन्युअल निपुणता की आवश्यकता होती है, इसलिए इसका अभ्यास किया जाना चाहिए। स्वचालित गिनती सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए दहलीज के बारे में निर्णय की आवश्यकता होती है, इसलिए रसीदों की तुलना आपके प्रयोग के लिए सर्वोत्तम मापदंडों की पहचान करने के लिए मैन्युअल गणना के साथ की जानी चाहिए। शुरू करने के लिए, मोती मापने वाली ट्रे पर 0.5-माइक्रोन ग्लास मोती डालें।
ट्रे पर मोतियों को फैलाएं ताकि सभी कुएं भरे और समतल हो जाएं। फिर, एक शंक्वाकार ट्यूब में अतिरिक्त मोतियों को ब्रश करें। अब, मापने वाली ट्रे पर एक अर्ध-स्कर्ट पीसीआर प्लेट को उल्टा रखें और इसे मापने वाली ट्रे पर इंडेंटेशन में फिट करके कुओं के साथ संरेखित करें।
फिर, मोतियों को स्थानांतरित करने के लिए इसे जल्दी से पलट दें। पीसीआर प्लेट की सतह से अतिरिक्त मोतियों को हटा दें। सुनिश्चित करें कि सभी कुओं में मोती हैं।
यदि आवश्यक हो, तो एक ही कुएं में मोती जोड़ने के लिए एक वजन स्कूप का उपयोग करें। फिर, एल्यूमीनियम पन्नी और ऑटोक्लेव के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट का उपयोग करने से पहले, 96-चैनल पाइपेटर का उपयोग करके मक्खियों को जोड़ने से तुरंत पहले प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
एनेस्थेटाइज्ड मक्खियों को सतह स्टरलाइज़ करने के लिए, एक छोटे फ़नल का उपयोग करके शीशी से मक्खियों को 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। तुरंत ट्यूब में 70% इथेनॉल के एक मिलीलीटर स्प्रे करें, ट्यूब को बंद करें, और 10 सेकंड के लिए व्युत्क्रमण द्वारा मिलाएं। फिर, किसी भी मक्खियों को एस्पिरेटेड करने से बचते हुए पी -1000 पिपेट के साथ इथेनॉल को एस्पिरेट करें।
अंतिम पीबीएस धोने के बाद, ट्यूब को बंद करें और इसे कैप साइड के साथ कुछ बार बेंच पर जोर से टैप करें ताकि मक्खियां कैप में जाएं। ट्यूब खोलने के बाद, मक्खियों को बल का उपयोग करके कुओं में डालें और प्रत्येक कुएं में एक मक्खी रखें। लोडिंग करते समय प्लेट को बर्फ पर रखकर मक्खियों को एनेस्थेटाइज रखें।
कुओं के करीब आवारा मोतियों को हटा दें, क्योंकि ये पन्नी सील को तोड़ सकते हैं और रिसाव का कारण बन सकते हैं। सुनिश्चित करें कि सीलिंग पन्नी का सुस्त पक्ष प्लेट पर नीचे की ओर उन्मुख है और चमकदार पक्ष गर्मी सीलर की ओर है। पांच सेकंड के लिए हीट सीलर को मजबूती से दबाएं और पन्नी को सुरक्षित करने के लिए हाथ के एप्लिकेटर से जला दें।
मक्खियों को पांच मिनट के लिए समरूप करें। सुनिश्चित करें कि मक्खियां पूरी तरह से समरूप हैं और समाधान रंगीन हो जाता है। सीलिंग पन्नी से तरल निकालने के लिए, 350 ग्राम पर एक मिनी प्लेट स्पिनर में 30 सेकंड के लिए मोती प्लेट को घुमाएं।
तीन आयताकार एमआरएस एगर विकास प्लेटों को कम से कम 10 मिनट तक सूखने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में उनके ढक्कन के साथ रखें। 96-चैनल पाइपेटर का उपयोग करके बाँझ 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर जोड़कर दो कमजोर पड़ने वाली प्लेटें तैयार करें। 96-चैनल पाइपटर पर पी -20 युक्तियों का एक रैक लोड करें।
नमूना प्लेट से होमोजेनेट के 11.1 माइक्रोलीटर को एस्पिरेटेड करके 1: 10 कमजोर पड़ने का प्रयास करें। अब, इसे पहली तनुकरण प्लेट में वितरित करें जिसमें प्रति कुएं बाँझ पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर होते हैं। 600 आरपीएम पर 10 सेकंड के लिए प्लेट शेकर पर तनुकरण प्लेट रखें।
कम से कम 10 बार ऊपर और नीचे पाइप करके फिर से मिलाएं। 11.1 माइक्रोलीटर को पहली तनुकरण प्लेट से दूसरी तनुकरण प्लेट में स्थानांतरित करें और किसी भी और कमजोर पड़ने के लिए मिश्रण चरणों को दोहराएं। प्लेटों को स्पॉट करने के लिए, प्रत्येक कुएं से 96-चैनल पाइपटर में दो माइक्रोलीटर लोड करें।
पाइपेटर के सिर को धीरे-धीरे प्लेट पर नीचे करें, आगर में छुरा घोंपने से बचें, और सुनिश्चित करें कि सभी धब्बे हटा दिए गए हैं। फिर, जांचें कि तरल धब्बे जल्दी से आगर में भिगो ते हैं और एक साथ नहीं चलते हैं। पांडुलिपि में वर्णित शेष तनुकरण प्लेटों के लिए चढ़ाना प्रक्रिया दोहराएं।
एक बार जब तरल पूरी तरह से आगर में अवशोषित हो जाता है, तो प्लेटों को उलटा करें और उन्हें तब तक सेनें जब तक कि उपनिवेश इष्टतम आकार तक नहीं पहुंच जाते। प्लेटों को तार्किक रूप से व्यवस्थित करें और फोटो खींचते समय उन्हें एक विशिष्ट क्रम में रखें। उन्हें उन्मुख करें ताकि ए 1 सभी प्लेटों के लिए ऊपरी बाएं कोने में हो।
प्लेट ढक्कन हटाने के बाद, प्लेट को सही कोने में ए 1 उन्मुख के साथ मंच पर रखें। प्लेटों को चित्रित करें। छवियों को कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें और उनका नाम बदलें, जिसमें प्रयोग का नाम, मीडिया प्रकार, कमजोर पड़ने वाला कारक और अन्य प्रासंगिक विवरण शामिल हैं।
फ़ोल्डर में परिमाणीकरण के लिए संसाधित किए जाने वाले चित्रों को व्यवस्थित करें। प्लेटों को अलग करने वाले फ़ाइल नाम आउटपुट स्प्रेडशीट में गणना के प्रत्येक सेट के लिए कॉलम शीर्षक बन जाते हैं। फ़ोल्डर में क्रॉप्ड और रसीदनामक सबफ़ोल्डर बनाएँ.
इन फ़ोल्डरों को आउटपुट फ़ाइलें प्राप्त होंगी। अब ImageJ से क्रॉपटेकुलर प्लगइन लॉन्च करें और फसल शुरू करने के लिए ओके पर क्लिक करें। स्रोत फ़ोल्डर चुनने के लिए एक संवाद बॉक्स पॉप अप होगा.
ठीक क्लिक करें. स्रोत फ़ोल्डर का चयन करें और खोलें क्लिक करें. फिर, गंतव्य निर्देशिका चुनने के लिए संवाद बॉक्स पर ठीक क्लिक करें। गंतव्य फ़ोल्डर का चयन करें और खोलें दबाएँ.
यदि छवि पहले से ही सीधी है, तो बस स्पेस दबाएं। अन्यथा, एक किनारे के साथ एक रेखा खींचकर छवि को सीधा करें जो क्षैतिज हो जाना चाहिए। यदि छवि सीधी दिखाई नहीं देती है तो लाइन को जितनी बार आवश्यक हो उतनी बार फिर से बनाएं।
इसके बाद, गिनती क्षेत्र के लिए एक सीमा बॉक्स खींचें और इसके आकार और अनुपात को समायोजित करें जब तक कि सभी धब्बे उनकी कोशिकाओं के भीतर न हों। ग्रिड को ताज़ा करने के लिए सीमा बॉक्स के बाहर कर्सर खींचें। जब ग्रिड अच्छा दिखता है, तो स्पेस दबाएं।
चूंकि प्लगइन सभी तस्वीरों को समान रूप से संरेखित करता है, इसलिए सुनिश्चित करें कि अगली छवि स्वचालित रूप से पहले वाले के समान कोण पर घूमती है। यदि यह सटीक है, तो जारी रखने के लिए Space दबाएँ. अन्यथा, छवि को पहले की तरह सीधा करें।
ग्रिड भी पिछली छवि के समान स्थिति को याद करता है। यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें और स्पेस दबाएं। काउंट-ऑन-इट लॉन्च करें और ग्रिडिरॉन का चयन करें।
ऊपरी और निम्न पिक्सेल तीव्रता मान के आधार पर थ्रेशोल्ड कॉलोनी तीव्रता सेट करें। सभी कॉलोनियों का चयन करते हुए सीमा को यथासंभव कठोर बनाएं। सीमा संतोषजनक होने पर कार्रवाई आवश्यक संवाद बॉक्स पर ठीक क्लिक करें, फिर जारी रखने के लिए ठीक क्लिक करें।
पहली छवि पर, सेटअप मेनू पर आगे बढ़ने या लौटने का विकल्प दिया गया है। बैच प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने के लिए, ठीक क्लिक करें. फिर, रसीदों और परिणाम तालिका को रखने के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें। पहले बनाए गए रसीद फ़ोल्डर का उपयोग करें।
पहली छवि के बाद, निम्नलिखित छवियां डिफ़ॉल्ट रूप से पिछली सेटिंग्स के समान सीमा तक पहुंच जाएंगी। इन सेटिंग्स का उपयोग करने या सेटिंग्स समायोजित करने के लिए ठीक क्लिक करें. सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पादित गणना रसीदों की समीक्षा करें और मैन्युअल रूप से किसी भी गिनती त्रुटियों को ठीक करें।
ImageJ प्लगइन सांख्यिकीय रूप से सटीक है, लेकिन त्रुटियां होती हैं। आउटलायर्स की जांच करने और गलत गिनती की पहचान करने के लिए रसीदों का प्रमाण दें। सॉफ्टवेयर CFU डेटा को प्राप्तियों के समान फ़ोल्डर में CSV फ़ाइल के रूप में सहेजता है।
लैक्टोबैसिलस प्लांटारम के साथ उपनिवेशित मक्खियों के लिए, मक्खियों के लिए बैक्टीरिया में उल्लेखनीय कमी आई थी, जिन्हें या तो रोजाना बाँझ भोजन में स्थानांतरित किया गया था, दैनिक रूप से स्थानांतरित किया गया था, विश्लेषण से चार घंटे पहले बाँझ भोजन पर रखा गया था, या दैनिक रूप से स्थानांतरित किया गया था और विश्लेषण से चार घंटे पहले बाँझ आगर पर रखा गया था, जो टीकाकरण के बाद कभी भी बाँझ भोजन में स्थानांतरित नहीं हुए थे। इसी तरह के परिणाम एसिटोबैक्टर इंडोनेसेंसिस-फेड मक्खियों में देखे गए, जहां स्थानांतरित, पोस्ट-ट्रांसफर और क्लियर्ड मक्खियों ने सीएफयू में महत्वपूर्ण कमी दिखाई, लेकिन धोने का औसत दर्जे का प्रभाव नहीं था, यह सुझाव देते हुए कि सीएफयू में कमी छल्ली के बजाय आंत से बैक्टीरिया की निकासी के कारण थी। प्रति स्थान 2 से 25 कॉलोनियों वाले स्थानों में सीएफयू गिनती ने पारंपरिक विधि की तुलना में कोई अंतर नहीं दिखाया।
35 कॉलोनियों के औसत वाले स्पॉट ने नियंत्रण प्रसार प्लेटों की तुलना में कम सीएफयू दिखाए। यह कमी घने स्थानों में अतिव्यापी कॉलोनियों के कारण हो सकती है। प्लेट तस्वीरों में, कॉलोनी की तीव्रता पृष्ठभूमि की तुलना में 300% अधिक थी।
लैक्टोबैसिलस प्लांटारम एमचेरी-पॉजिटिव कॉलोनियों ने एमचेरी-नकारात्मक कॉलोनियों की तुलना में 1,000% अधिक लाल तीव्रता प्रदर्शित की। एसिटोबैक्टर इंडोनेसेंसिस जीएफपी-पॉजिटिव कॉलोनियों ने जीएफपी-नकारात्मक कॉलोनियों की तुलना में 200% अधिक हरी तीव्रता दिखाई। इमेजजे के लिए काउंट-ऑन-इट प्लगइन प्लेट तस्वीरों से सीएफयू गिनती को स्वचालित करता है।
कॉलोनियों का सटीक रूप से पता लगाया जाता है, मैनुअल गिनती के लिए तुलनीय गणना के साथ। गणना रसीदों का उपयोग गलत गणना की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। आकार सीमा और प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य बदलने से विभिन्न कॉलोनी आकृति विज्ञान को अलग-अलग गिना जा सकता है।
यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि मोती मोती से पहले प्लेट अच्छी तरह से सील हो। अपने माप को कैलिब्रेट करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण डिजाइन करना भी महत्वपूर्ण है। हम इस तकनीक का उपयोग 96-वेल प्लेटों में बैक्टीरिया की इन विट्रो आबादी का अध्ययन करने के लिए भी करते हैं, जो हमें बैक्टीरिया के मिश्रित समुदायों का अध्ययन करने देता है।
यह तकनीक आंत उपनिवेशीकरण के साथ-साथ उपनिवेशीकरण में जैविक भिन्नता को मापने के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण की अनुमति देती है।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
