Medicine
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激光诱导动作电位样测量微电极阵列上的心肌细胞，以提高安全药理学的预测性
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激光穿孔和微电极阵列（MEA）的组合允许对培养的原代和干细胞来源的心肌细胞进行类似动作电位的记录。波形形状提供了比标准记录更深入的测试化合物作用方式的洞察力。它将膜片钳和MEA读数连接在一起，以进一步优化未来的心脏安全研究。
Transcript
该方法能够在传统MEA上记录细胞内相似的动作电位，从而可以更好地描述AP形状和更灵敏地分类促心律失常电位。与典型的场电位记录相比，细胞内的实际电位形状提供了对潜在离子通道的精确授权的更多见解。当通过干细胞技术应用于来自临床患者的心肌细胞时，该方法有助于因果诊断，C R P和心律失常等心脏病的个性化我们的技术人员Karin Gebhardt将演示心肌细胞培养。
为了开始涂覆先前高压灭菌的MEA的电极场，在层流罩下使用10微升移液管滴加纤连蛋白。为了减少渗透休克，将电镀溶液滴入含有解冻心肌细胞的50毫升管中90秒。将八毫升电镀介质轻轻加入试管中，并小心地混合细胞悬液。
使用10毫升移液管，除去上清液，确保不丢弃沉淀并将细胞数调整至最终浓度。在细胞就位之前，使用10微升移液管从MEA电极区域去除涂覆的涂层溶液。为了避免涂层立即干燥，将四微升的细胞滴加到电极场上，六个孔MEA和一个孔M E A.现在，让细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下粘附在孔中一小时。
在层流罩下，加入200微升和1毫升加热至37摄氏度的无菌电镀介质，分别用于6孔MEA和单孔MEA。对于MEA记录，将MEA系统放在设备顶部，MEA芯片支架位于物镜孔的中心。然后通过定位MEA设置使激光聚焦在电极上，使物镜直接位于MEA系统的孔下方。
为了使细胞从机械干扰中恢复，请在记录前15分钟将带有培养细胞的MEA芯片从培养箱转移到MEA设置中。接下来，使用异丙醇棉签仔细清洁接触垫和针脚以降低噪音水平。将 MEA 小心地放入 MEA 设置中，并将序列号可见的六孔 MEA 芯片放置在右侧，或将参比电极放在左侧的单孔 MEA 芯片中。
现在，将MEA系统集成加热设置为38摄氏度。关闭设备的盖子，因为集成的安全开关只允许激活激光 如果盖子在 MEA 芯片上关闭。使用 MEA 配置程序将高通和低通 MEA 系统滤波器分别设置为 0.1 赫兹或更低和 3， 500 赫兹。
使用 MC 机架软件或任何其他软件进行录制。根据实验调整输入范围。确保信号不会使放大器和采样率饱和。
使用软件的长期显示功能检查录音。将MEA芯片插入MEA设置并设置软件后，使用FB ALP软件初始化激光力学。现在，单击初始化按钮。
在初始化结束时，对于六孔MEA，虚拟激光点将分别位于D井中，对于单孔MEA，虚拟激光点将分别位于左下角。然后使用鼠标单击的控制键将虚拟激光点移动到D五电极的中间，并通过按住控制键并用鼠标滚轮滚动来调整焦点。或者，使用自动对焦功能。
按下按钮设置P一，虚拟激光点将自动移动到孔F中。根据实验要求调整激光功率和处理时间。要启用激光，请单击激光关闭按钮，该按钮将显示为激光打开，切换到录制软件。
选择一个文件名，然后单击红色记录按钮，然后单击窗口顶部的播放按钮以记录测量结果。在用激光打开细胞之前记录基线60秒。切换回初始化软件，并在软件窗口右侧的虚拟地图上停用要被激光排除的电极。
要启动激光，请使用Alt鼠标单击，并选择此孔的中心电极。这启动激光自动打开该孔的每个电极上的细胞，对每个孔重复以打开该选定孔的所有先前激活的电极。首先将毫摩尔浓度的硝苯地平E-40 31和多非利特溶解在DMSO中，然后在完全培养基中溶解至所需浓度的10倍。
切勿超过孔中最终DMSO浓度的0.1%。记录基线活动 60 秒。如前所述，启动激光诱导，导致FPS转换为liAP。
以每孔单浓度应用所有药物。分别从六孔和单孔MEA中每孔去除20微升和100微升培养基。向孔中加入20微升或100微升待测的药物储备溶液。
根据 MEA 类型，小心地上下移液两到三次。让化合物冲洗 300 秒。在此期间，liAP 形状可能会转变为 FP 形状。
再次，诱导激光诱导穿孔并在liAP上记录可能的化合物诱导缺陷60秒。硝苯地平的加入以浓度依赖性方式降低了liAPs的平台期，从而缩短了整个liAPs。这种缩短与来自未操纵电极的心肌细胞的场电位相当。
E-40 31抑制相关KV单点11钾通道的复极化，导致心肌细胞在浓度增加时的心律失常行为。此外，E-40 31以浓度依赖性方式增加了liAP持续时间。在liAP结束时，在0.1微摩尔处观察到小的正电压偏转，随着浓度的增加而变得更加突出，表明称为EAD的瞬态新去极化。
在0.1微摩尔的最高浓度下，这些EAD随着时间的推移升级为异位搏动。哪些是过早的动作电位。EAD 和异位搏动是促心律失常活动的关键指标。
最后，电活动导致心律失常跳动。浓度反应关系与FP和liAP记录相关。此外，在多非利特存在下，FP和liAP在同一孔内均显示出约两秒的持续时间，FP波形呈现规则的复极偏转。
在liAP中，EAD是可检测到的。在每个旋律之前调整焦点很重要，因为失焦显微镜图像可能会影响细胞的开放。此外，在优化后不久就采取动作电位进行分析。
与标准MEA相比，该技术在检测先前的心律失常效应方面更敏感，可以更精确地检测不良化合物效应。
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