Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En metod för att studera α-synukleintoxicitet och aggregering med hjälp av en humaniserad jästmodell
Chapters
Summary November 25th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
En in vivo fysiologisk modell av α-synuklein krävs för att studera och förstå patogenesen av Parkinsons sjukdom. Vi beskriver en metod för att övervaka cytotoxicitet och aggregatbildning av α-synuklein med hjälp av en humaniserad jästmodell.
Transcript
Detta är en enkel metod för att övervaka cellulära fenotyper och funktioner hos R-passkärnor. Det kan också ofta återvinnas i genomomfattande studier för att hitta de genetiska faktorer som påverkar stabiliteten hos R-passkärnor. Eftersom detta är en väletablerad motororganism är denna teknik lätt och kräver inte mycket tid och ansträngning jämfört med att använda mänskliga cellinjer eller djurmodeller.
Aggregeringen av R-passkärnor är nära associerad med Parkinsons sjukdom. De proteiner eller kemikalier som sannolikt påverkar stabiliteten hos R-pass-kärnor kan testas i denna humaniserade jästmodell. Till att börja med, lappa tre enskilda kolonier på en SD-URA-agarplatta för val av celler som innehåller alfa-synukleinplasmider.
Inokulera sedan de tre-lappade jästtransformationsformanterna per stam i 3 ml SRD-URA för selektiv tillväxt av jäst innehållande plasmiderna med 2% raffinos för hämning av induktionen av alfa-synuklein under Gal1-promotorn och 0,1% glukos. Inkubera den inokulerade kulturen vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut. Nästa dag, inokulera de odlade cellerna över natten till 3 ml färsk SRD-URA tills de når en optisk densitet på 0,2 vid 600 nanometer.
Inkubera sedan kulturen i sex timmar vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut. Mät den optiska densiteten vid 600 nanometer med hjälp av en spektrofotometer. Späd sedan proverna till en optisk densitet av 0,5 vid 600 nanometer med sterilt destillerat vatten i bana 1 på en 96-brunnsplatta för att utjämna antalet celler i varje kultur.
Utför 5-faldiga seriella utspädningar av jästcellerna genom att tillsätta 160 mikroliter sterilt destillerat vatten till de följande fem banorna och säkerställa en total volym på 40 mikroliter vid serieutspädning av cellerna i varje körfält. Använd en flerkanalig pipett för att överföra 10 mikroliter från varje brunn för att upptäcka proverna på SD-URA-agarplattor för kontrollerna och SG-URA-agarplattorna för att övervaka toxiciteten. Inkubera de fläckiga plattorna upp och ner i 30 grader celsius i fyra dagar.
Ta bilder av plattorna var 24: e timme fram till dag fyra och analysera sedan data genom att jämföra tillväxtskillnaderna mellan stammar som upptäcks av ögat. Inokulera de tre lappade jästtransformanterna per stam till tre milliliter SRD-URA och inkubera vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut över natten. Nästa dag, mäta den optiska densiteten hos cellerna som odlas över natten på 600 nanometer och inokulera cellerna i totalt 200 mikroliter färsk SD-URA och SG-URA i 96-brunnsplattor.
Justera den slutliga volymen inklusive cellerna till 200 mikroliter och justera den ursprungliga celloptiska densiteten till 0,05 vid 600 nanometer. Justera programinställningarna i mikrotiterplattan. Ställ in måltemperaturen på 30 grader, intervalltiden till 15 minuter, skakningstiden till 890 sekunder, skakningsamplituden till 5 millimeter och mätningen som absorbans vid 600 nanometer.
Inkubera plattan i 2-3 dagar för att alla stammar ska nå den stationära fasen i en mikroplattläsare. Analysera data genom att rita tillväxtkurvan. Inokulera de lappade jästtransformationsmedlen till 3 ml SRD-URA och odla dem över natten vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut.
Nästa dag, ominokulera de odlade cellerna över natten till 3 ml färsk SRD-URA till en optisk densitet av 0,003 vid 600 nanometer, inkubera sedan kulturen vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut tills den optiska densiteten når 0,2. Tillsätt sedan 300 mikroliter 20% galaktos och inkubera sedan i ytterligare 6 timmar vid 30 grader celsius under agitation vid 200 rotationer per minut. Samla en milliliter av cellkulturen genom centrifugering vid 800 g i 5 minuter och kassera supernatanten.
Återsuspendera cellpelleten försiktigt i 30 mikroliter destillerat vatten. Förbered en agarosgelkudde på en glasskiva. Återsuspendera cellerna och ladda fem mikroliter av cellresuspensionen på glasskivan och täck cellerna med den skurna agarosplattan för undersökning.
För att utföra mikroskopisk avbildning med ett 100x-mål, använd skärmdumpalternativet för att generera bilder med programmet och välj ljusfält för att fokusera cellen med ett 100x-mål med nedsänkningsolja. Byt till ett GFP-fluorescensfilter och justera bildexponeringstiden till mellan 50 millisekunder och 300 millisekunder för att uppnå en tydlig bild genom att balansera signal-brusförhållandet. Öppna bildfilen och analysera data genom att räkna cellerna baserat på antalet foci i cellerna med hjälp av bildanalysprogramvara.
Synukleinuttrycket under Gal1-promotorn i PRS426-vektorn visade signifikant tillväxtfördröjning på agarplattan innehållande galaktos som inducerare. Skillnaden i tillväxt genom synukleinuttryck observerades också i flytande kulturer. Under båda odlingsförhållandena visade synuklein av vild typ och varianter med E46K- eller A53T-mutationer tillväxtfel på grund av synukleintoxicitet.
Synuklein A30p-varianten, som inte bildar aggregat, visade emellertid en giftfri fenotyp. Stammarna som uppvisade allvarlig cytotoxicitet visade foci av synukleinaggregat, men i A30p-varianten diffunderades en mindre toxisk form av synuklein genom cellerna. För att uppnå reproducerbara resultat är det viktigt att använda cellen i samma tillväxtstadium i varje experiment, särskilt när du övervakar synukleinassocierade fenotyper.
Som vi har visat i fluorescerande mikroskopdata kan synuklein bilda större aggregat. Därför kan den helt enkelt fraktioneras genom centrifugering och kan kvantifieras genom western blotting med hjälp av synukleinspecifik antikropp. Denna teknik är tillämplig för screening med hög kapacitet för att hitta nya genetiska faktorer och kemiska föreningar som påverkar aggregeringen av synuklein.
Därför hoppas vi kunna hitta nya terapeutiska kandidater för Parkinsons sjukdom.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
