הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות

פרוטוקול מיקרוסקופי קונפוקלי זה יאפשר פרשנות של ההתנהגות האקולוגית וההתאמות של מיקרו-אצות מסביבות קיצוניות עם גידול איטי במעבדה באמצעות אוטופלואורסצנטיות של הפיגמנטים שלהן. טכניקה זו אינה פולשנית וממזערת ממצאים מכיוון שלא נעשה שימוש בתרכובות כימיות. לדעת את הביצועים של פיגמנטים של autotrophs וצמיחה מקבילה יאפשר את העיצוב של שיטות שליטה, שהוא העניין הגדול ביותר עבור מערות תיירותיות ומונומנטים אדריכליים.

התחל להכין את החיסון של Chroothece mobilis על ידי העברתו מתרבית האגר למדיום מי הים או המדיום הנוזלי SWES. שמרו על כל התרביות במשך שבועיים עם תקופת צילום כהה בהירה של 16 עד 8 מעלות צלזיוס ב-20 מעלות צלזיוס בעוצמת אור לבנה נמוכה וללא רעידות עד לקבלת צפיפות התאים הרצויה. השתמש מיליליטר אחד של תרבית הפאזה המעריכית שיש פי חמש 10 לתאים השלישי לכל מיליליטר צפיפות התא כדי לחסן בצלחת של 24 בארות לניסויים שונים.

כדי לשחזר את אפקט האור המונוכרומטי, השתמש במסנן הירוק המאפשר לאור ירוק לעבור מ-470 עד 570 ננומטר עם שיא באורך גל של 506 ננומטר ולאור אדום מותאם באמצעות מסנן בין 590 ל-720 ננומטר ושיא של 678 ננומטר. חשפו את תרביות התאים לאור זה במשך שבועיים. הפעל את כל רכיבי מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ההפוך כולל הלייזר.

הרכיבו את התאים במצע הגידול SWES מכל באר ניסויית של צלחת 24 בארות לצלחת תחתית זכוכית 35 מ”מ להדמיה. בחר את מטרת הצמצם המספרי 63X או 1.30 או את מטרת הטבילה של גליצרול NA והנח את הגליצרול מעל העדשה. לאחר מכן, הניחו את צלחת הבאר על במת המיקרוסקופ וודאו שהדגימה אינה זזה במהלך רכישת התמונה.

מרכז את הדגימה בנתיב האור והתמקד במרכז התא על ידי בחירת המישור בעל עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר. לאחר שתסיים, פתח את תוכנת רכישת התמונות ובחר XY lambda מהרשימה הנפתחת במצב רכישה. בחר את קו העירור של הלייזר 561 ננומטר, שמונה סיביות של טווח דינמי ו 1024 על 1024 פיקסלים.

אסוף את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית ברוחב פס של 10 ננומטר ואת גודל מדרגת למדא של ארבעה ננומטר בטווח של 570 עד 760 ננומטר. הגדר את חור הסיכה ביחידת אוויר אחת והפעל את רכישת סריקת למדא. לאחר חזרה על תהליך זה בשדות ראייה שונים ובתנאים שונים של אורות אדומים וירוקים, שמור את כל הנתונים.

לאחר רכישת סריקת הלמדא, לחץ על חלון הכימות בחלק העליון של התוכנה כדי להעריך את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי שנאסף. עבור אל חלון הפרויקט הפתוח ובחר קובץ XY lambda אחד. בחר ניתוח פרופיל מוערם בתוכנת ההדמיה והגדר אזור עניין של ארבעה מיקרומטר מרובע במרכז התא כדי לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת.

יצא את הנתונים ואת CSV לפני חזרה על התהליך עם תאים שונים בתנאים שונים. לאחר מכן, פתח את קובצי CSV כדי לבחור את שיאי הפלואורסצנטיות השונים של כל אזורי העניין הנמדדים על ידי בחירת הנתונים הפלואורסצנטיים המרביים של פיקואריתרין פיקוציאנובילין, C.phycocyanin, allophycocyanin וכלורופיל A בהתאמה בקובץ CSV. לאחר שתסיים, צור טבלה חדשה עם כל ערכי הפלואורסצנטיות המרביים המתקבלים מכל שיא של פיקובילין וכלורופיל והתווה את הנתונים על גרף.

נצפו הבדלים משמעותיים בעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת. עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של פיקואריתרין פיקוציאנובילין ירדה באופן משמעותי כאשר התאים נחשפו לאור ירוק מונוכרומטי. לעומת זאת, לא נצפה הבדל באור אדום לעומת קבוצת הביקורת.

לאור הירוק הייתה השפעה הפוכה על אלופיקוציאנין וכלורופיל A, שבהם עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת גדלה באופן משמעותי עקב הסתגלות של מתחמי אנטנות עקב כמות מוגברת או קישוריות משופרת של מתחמי האנטנות, בין היתר. האור האדום גרם לעלייה לא משמעותית באלופיקוציאנין ובכלורופיל פלואורסצנטי. כדי לחקור את ההשפעה של תנאי גדילה שונים על תאים בתרבית, חיוני לבצע את המדידות עם אותן הגדרות מיקרוסקופ בדיוק.

ניתן לנתח פרמטרים סביבתיים אחרים הרלוונטיים לתרבית של אורגניזמים אוטופלואורסצנטיים, כמו גם את האות הפלואורסצנטי בתוך הספקטרום הנראה. טכניקה זו היא גישה חזקה מאוד לחקר אורגניזמים חיים עם מספר פיגמנטים אוטופלואורסצנטיים.