Cancer Research
This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Tekniska onkogena heterozygota förstärkningsmutationer i humana hematopoetiska stam- och stamceller
Chapters
Summary March 10th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Nya strategier för att troget modellera somatiska mutationer i hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) är nödvändiga för att bättre studera hematopoetisk stamcellsbiologi och hematologiska maligniteter. Här beskrivs ett protokoll för att modellera heterozygota gain-of-function-mutationer i HSPCs genom att kombinera användningen av CRISPR/Cas9 och dubbel rAAV-givartransduktion.
Transcript
Denna metod möjliggör exakt modellering av återkommande leukemogena gain-of-function-mutationer i primära humana hematopoetiska stam- och stamceller och därigenom undersöka rollen i leukemisk transformation. Den största fördelen med denna teknik är att den CRISPR-Cas9-baserade mutationstekniken kombineras med introduktionen av en fluorescerande reporter. Detta möjliggör unikt identifiering, anrikning och spårning av rena heterozygöst muterade cellpopulationer.
Demonstrerar proceduren kommer att vara Tommaso Sconocchia, en postdoktoral forskare från mitt laboratorium. För att börja, designa det enda guide-RNA med hjälp av online Benchling-designverktyget genom att välja alternativet plussskapa. Klicka sedan på DNA-sekvens"följt av importera DNA-sekvenser"och importera från databaser"alternativ.
Ange sedan önskad gen och välj människa"som art. Klicka på sökalternativet och välj rätt transkriptimport. Välj den intressanta regionen där du vill införa dubbelsträngsbrytningen.
Välj sedan alternativet CRISPR" till höger på skärmen, följt av design- och analysguider. Välj sedan en guide"samtidigt som du behåller guidelängden till 20 baspar och PAM-sekvens för redigering med SP-Cas9. Välj en guide med en hög poäng på målet och en hög poäng utanför målet och beställ det enda guide-RNA som ett kemiskt modifierat syntetiskt enda guide-RNA från en kommersiell leverantör.
För att designa HDR-mallen, importera den genomiska sekvensen och kodningssekvensen till programvara för molekylär kloning. Från den genomiska sekvensfilen designar du den vänstra homologiarmen genom att helst välja 400 baspar på de fem främsta ändarna av dubbelsträngsbrytningarna och klistra in denna sekvens i en ny fil. Från den genomiska sekvensfilen designar du skarvacceptorsekvensen genom att välja de sista 150 basparen i den riktade intronen och klistra in den efter den vänstra homologiarmen.
Från kodningssekvensfilen väljer du det cDNA som är av intresse. Kodon optimerar cDNA och sätter in det efter skarvacceptorsekvensen. Efter cDNA av intresse, sätt in en tre prime polyadenylationssignal efter en promotorsekvens för det fluorescerande proteinet.
Sätt sedan in sekvensen för det fluorescerande proteinet och en andra, men annorlunda polyadenylationssignal. Från den genomiska sekvensfilen designar du den högra homologiarmen genom att välja idealiskt 400 baspar på de tre främsta ändarna av dubbelsträngsbrotten och sätt in sekvensen efter den andra polyadenyleringen. Skapa sedan en kopia av hela mallen och ändra cDNA av intresse så att den innehåller sekvensen för den önskade mutationen.
Byt ut det fluorescerande proteinet mot ett annat fluorescerande protein. Konstruera och klona HDR-mallarna till AAV-uttrycksvektorn. För rekombinant AAV6-beredning, förbered 10 150 millimeter rätter vardera innehållande 11 miljoner HECK293T i 20 ml DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% penicillin streptomycin och 25 millimolar HEPES.
Placera sedan diskarna i inkubatorn vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid, i 24 timmar. Efter att ha kasserat det gamla mediet noggrant, byt ut det med 20 ml antibiotikafri DMEM kompletterat med 10% FBS, 25 millimolar HEPES och ett millimolärt natriumbutyrat. Förbered sedan två 15 ml rör märkta rör ett och två.
För att röra en, tillsätt fem milliliter reducerat serummedium, 60 mikrogram rekombinant AAV6-muterad HDR-plasmid och 220 mikrogram PDGM6-hjälparplasmid. För att röra två, tillsätt fem milliliter reducerat serummedium och 1120 mikroliter av ett milligram per milliliter polyetenaminlösning. Efter tillsats av innehållet i rör två till rör ett, virvel i 30 sekunder och inkubera sedan i 15 minuter vid rumstemperatur.
Tillsätt försiktigt droppvis 1,1 ml av lösningen till varje maträtt och fördela genom att virvla försiktigt. Placera diskarna i inkubatorn vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid, i 48 timmar. Tillsätt sedan 250 mikroliter 0,5 molar EDTA till varje maträtt och placera dem i inkubatorn i 10 minuter.
Skörda cellerna genom att tvätta dem från skålen och överför till ett 500 ml centrifugrör. Centrifugera vid 2000 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernatanten. Lossa pelleten genom att virvla och extrahera viruset med hjälp av ett AAV-reningssats.
Efter att ha aliciterat det renade viruset, förvara det vid minus 80 grader Celsius. Efter upptining av CD34-positiva hematopoetiska stam- och stamceller, överför cellerna till 10 ml förvärmd RPMI kompletterat med 1% penicillinstreptomycin. Centrifugera vid 350 g vid rumstemperatur i 10 minuter.
Suspendera cellerna i hematopoetiskt stam- och stamcellsretentionsmedium till en koncentration av 250 000 celler per milliliter och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 72 timmar. Skörda sedan cellerna i ett 15 ml rör. Räkna och kontrollera cellviabiliteten genom trypanblå uteslutning.
För att bereda ribocucleoproteinkomplexet, tillsätt 15 mikrogram Cas9 och åtta mikrogram enkelstyrt RNA i ett 1,5 ml rör och inkubera vid 25 grader Celsius i 10 minuter i ett värmeblock. Medan ribonukleoproteinkomplexet inkuberar, centrifugera cellerna vid 350 G i fem minuter och kassera supernatanten. Efter att ha suspenderat cellerna i 100 mikroliter nukleofektionslösning, blanda cellerna med ribonukleoproteinkomplexet och överför dem till kyvetten.
Efter att ha knackat försiktigt på kyvetten för att ta bort eventuella kvarvarande luftbubblor, sätt in kyvetten i hållaren av transfektionssystemet och elektropolera cellerna. Omedelbart efter elektroporering, tillsätt 400 mikroliter förvärmd hematopoetisk stam och förfäder cellretentionsmedium utan penicillinstreptomycin och överför cellerna med en fin överföringspipett till en odlingsplatta innehållande förvärmd hematopoetisk stam och stamcellsretentionsmedium utan penicillinstreptomycin. Överför sedan plattan till inkubatorn.
Tina injektionsflaskorna som innehåller de frysta rekombinanta AAV: erna på is och transducera cellerna genom att pipettera den optimala mängden av varje rekombinant AAV6 till cellsuspensionen. Efter att ha blandat cellsuspensionen försiktigt med pipetten, inkubera de transducerade cellerna i sex till åtta timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Efter sex till åtta timmar, samla cellerna i ett rör och centrifugera dem vid 350 G vid rumstemperatur i fem minuter.
Kassera supernatanten och ersätt den med färskt förvärmt hematopoetiskt stam- och stamcellsretentionsmedium kompletterat med penicillinstreptomycin och överför cellerna till en cellodlingsplatta. Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. För att flödessortera de konstruerade cellerna som bär den heterozygota funktionsförstärkningsmutationen, skörda cellerna i ett 15 milliliter rör och centrifugera vid 350 G vid rumstemperatur i fem minuter som visats tidigare.
Ta bort supernatanten och suspendera cellerna i en milliliter DPBS innehållande 0,1% PSA och centrifugera igen vid 350 G vid rumstemperatur i fem minuter. Efter att ha kastat supernatanten, suspendera cellerna i en lämplig volym DPBS plus 0,1% BSA beroende på cellnumret som visats tidigare. Överför cellerna till ett sterilt faxrör utrustat med ett lock och tillsätt sju AAD eller annat viabilitetsfärgämne till cellsuspensionen för uteslutning av levande / döda celler.
Sortera de levande cellerna som är dubbelpositiva för de fluorescerande reporterproteinerna i ett uppsamlingsrör som innehåller 200 mikroliter hematopoetisk stam och stamcellsretentionsmedium. Efter centrifugering av de sorterade cellerna vid 350 G vid rumstemperatur i fem minuter som visats tidigare, till en koncentration av 250 000 celler per milliliter för vidare expansion i odling eller använd cellerna direkt för funktionella analyser. Två dagar efter transvektion med ribonukleoproteinkomplexet och transduktion med de rekombinanta AAV6-virusen analyserades cellerna med flödescytometri.
Fyra huvudpopulationer upptäcktes, inklusive celler utan HDR-baserad genomredigering som varken uttryckte GFP- eller BFP-cellerna positiva endast för GFP med endast den vilda typkonstruktionen integrerad, celler positiva endast för BFP med endast den muterade konstruktionen integrerad, och GFP och BFP dubbla positiva celler med både vild typ och muterade sekvenser integrerade. För att validera den framgångsrika knock-in av de heterozygota calreticulinmutationerna in / ut utfördes PCR på genomiskt DNA extraherat från celler inkuberade med endast AAV och från celler inkuberade med ribonukleoproteinet och AAV med den inslagna calreticulin wild-typen och calreticulin-raderingssekvensen. Celler sorterades baserat på det samtidiga uttrycket av båda fluorescensreportrarna före DNA-extraktion.
Efter gelelektrofores skars enskilda band ut från gelén och DNA extraherades för efterföljande Sanger-sekvensering. Sekvenseringsresultaten bekräftade den framgångsrika sömlösa integrationen av den vilda typen och muterade sekvenser i de heterozygota kalkylmuterade hematopoetiska stam- och stamcellerna. Det viktigaste att komma ihåg när du försöker denna procedur är att noggrant välja det bäst presterande enskilda guide-RNA, eftersom detta kommer att avgöra den totala HDR-effektiviteten och därmed frekvensen av framgångsrik knock-in av heterozygota mutationer.
Efter denna procedur kan de genetiskt modifierade cellerna användas för funktionella in vitro- och in vivo-experiment, såsom kolonibildande enhetsanalyser, differentieringsanalyser och transplantation till immunbristmöss.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
