Isolatie en cultuur van beenmerg-afgeleide macrofagen van muizen

Dit protocol is gericht op het verkrijgen van grote hoeveelheden niet-gestimuleerde macrofagen die zijn afgeleid van beenmerg en nooit zijn blootgesteld aan weefselfactoren of cytokines. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het aantal cellen dat van een enkel dier wordt verkregen. Met de juiste procedure kunnen ongeveer 2 keer 10 tot de macht 7 macrofagen worden verkregen.

Deze methode zou onderzoekers kunnen helpen uit verschillende gebieden die macrofagen bestuderen, zoals celbiologie, pathologie, immunologie en parasitologie, Omdat cellen altijd vatbaar zijn voor besmetting, zijn voorzichtigheid met alle steriele stappen en het gebruik van een bioveiligheidskast met laminaire stroming noodzakelijk om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. De procedure zal worden gedemonstreerd door Izabela Aparecida de Souza. Een masterstudent uit ons laboratorium.

Om de procedure te starten op de correct geëuthanaseerde acht weken oude C57BL/6 wildtype mannelijke muis, weekt u de muis met 70%ethanol oplossing. Maak met een steriele schaar een incisie van een centimeter langs de buik en verwijder de huid totdat de spier van de achterpoten volledig bloot ligt. Verwijder vervolgens voorzichtig de achterpoten ter hoogte van de heup zonder het dijbeen en scheenbeen te breken.

Doe de intacte achterpoten in een conische centrifugebuis met 70%ethanoloplossing. Breng in een bioveiligheidskast met laminaire stroom de geïsoleerde poten over van 70%ethanol naar steriel PBS. Reinig met een tang en desinfecterende doekjes de botten door alle aangehechte spieren en fascia te verwijderen.

Gebruik vervolgens een steriel chirurgisch scalpelmesje om de botepifyse aan beide uiteinden door te snijden, waardoor het beenmerg bloot komt te liggen. Vul een spuit van 20 milliliter met 10 milliliter steriele PBS aangevuld met 2% penicilline-streptomycine-oplossing en sluit er een naald van 26 gauge op aan. Houd het bot vast met behulp van een anatomische dissectietang met één hand.

Gebruik de andere hand om de naald voorzichtig in de botholte te steken zonder het bot te verpletteren. Spoel vervolgens de binnenkant van het bot uit met PBS en verzamel het beenmerg in een steriele kegelvormige centrifugebuis. Eenmaal gewassen, zou de botholte er wit uit moeten zien.

Centrifugeer de verzamelde cellen bij 300G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in één milliliter DMEM/F1210-medium. Homogeniseer de suspensie en voeg nog eens negen milliliter van het medium toe om het totale volume op 10 milliliter te brengen.

Voeg een milliliter van de voorlopercelsuspensie toe aan elk van de 10 ronde plastic petrischaaltjes van 100 milliliter bij 20 millimeter. Verdeel de cellen met een pipet over de platen om een gelijkmatige verdeling te verkrijgen. Voeg vervolgens negen milliliter DMEM/F1210 aangevuld met 20% L929-celsupernatans toe aan elk gerecht.

Incubeer de gerechten bij 37 graden Celsius en 5% koolzuurgas. Voeg op de derde dag 10 milliliter DMEM/F1210 medium toegevoegd met 20% L929-celsupernatans toe aan elk gerecht. De resulterende 20 milliliter kweekmedium in elk gerecht is voldoende voor celgroei tot rijping.

Gooi de supernatanten van alle kweekgerechten weg. Was elke kweekschaal met 10 milliliter steriele magnesium en calciumvrije PBS, voorverwarmd tot 37 graden Celsius, en gooi de oplossing na het wassen weg. Voeg aan elk gerecht drie milliliter niet-enzymatische celdissociatieoplossing toe, voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik vervolgens een omgekeerde microscoop om te visualiseren of de macrofagen zich dissociëren van de celkweekschalen. Gebruik een serologische pipet om de vaat te wassen met de oplossing voor niet-enzymatische celdissociatie, waarbij u herhaaldelijk cirkelvormige bewegingen uitvoert om volledige macrofaagdissociatie te garanderen.

Verzamel en combineer de oplossing van alle kweekschaaltjes in een conische centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg nogmaals 10 milliliter steriele, voorverwarmde PBS toe aan de lege kweekschaaltjes. Centrifugeer de conische buis met de gecombineerde verzamelde oplossing bij 300 G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met één milliliter DMEM/F1210. Homogeniseer de suspensie langzaam en voorzichtig door deze op en neer te pipetteren zonder de cellen te beschadigen. Verdun een aliquot van 10 microliter van de macrofaagoplossing door 10 microliter trypanblauw toe te voegen om de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.

Op dag zeven zou elk gerecht ongeveer 2 miljoen macrofagen produceren. Blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor van L929 supernatant transformeerde geleidelijk de beenmergvoorlopercellen tot volwassen macrofagen, met een typische verspreide morfologie als gevolg van cytoplasmatische extensies. Op dag drie zijn er een paar onvolwassen macrofagen verschenen, met een typische ronde vormmorfologie met weinig membraanprojecties.

Hoewel ze gedurende het hele proces transformeerden, waren er zeven dagen nodig om een adequaat aantal en volwassenheid te bereiken. De verkregen macrofagen vertoonden een homogene populatie in termen van grootte en granulariteit in de flowcytometrieanalyse. Bovendien bracht 100% van de populatie de karakteristieke F480- en CD11B-oppervlaktemoleculen tot expressie, waardoor een enkele goed gedefinieerde celpopulatie werd gevormd.

Het fagocytosevermogen van de rijpe en goed gedifferentieerde macrofagen werd bevestigd door fluorescentiemicroscopiebeelden die de belangrijkste parasieten van fagocytose Leishmania in de macrofagen toonden. De poten moeten voorzichtig van het dier worden verwijderd, omdat dit in een niet-steriele omgeving wordt uitgevoerd en de belangrijkste bron van besmetting is. Poten mogen niet worden gebroken buiten de bioveiligheidskast met laminaire stroming.

De van beenmerg afgeleide macrofagen die uit dit protocol zijn verkregen, kunnen vervolgens worden gebruikt om macrofaag in vitro polarisatie uit te voeren om de fysiologie van macrofagen te begrijpen.