This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analysere mitokondriell morfologi gjennom simuleringsovervåket læring
Chapters
Summary March 3rd, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen forklarer hvordan du bruker simuleringsovervåket maskinlæring for å analysere mitokondrienes morfologi i fluorescensmikroskopibilder av faste celler.
Transcript
Vi demonstrerer bruken av et simuleringsovervåket maskinlæringsverktøy for å analysere mitokondrier i fluorescerende mikroskopibilder av faste celler. Nåværende metoder for å segmentere mitokondrier i mikroskopibilder inkluderer automatiske terskelbaserte metoder som Ostu eller manuell segmentering. Terskelbaserte teknikker fungerer dårlig der signal- og bakgrunnsforholdet er lavt.
Vanligvis har bilder for morfologisk analyse et stort antall mitokondrier, noe som gjør manuell segmentering kjedelig. Overvåkede dype læringsmetoder utfører segmentering med høy nøyaktighet, men krever et stort antall input ground-truth pair-data for trening. Denne tilnærmingen bruker en fysikkbasert simulator for å generere par mikroskopibilder, og deres 2D bakke-sannhetsformmaske, og eliminerer dermed behovet for manuell merknad.
Modellen trent på simulerte bilder blir deretter brukt til å segmentere mitokondrier i ekte mikroskopbilder. Vi bruker et dyplæringsbasert segmenteringsverktøy som muliggjør automatisering av denne oppgaven med høy nøyaktighet, og som ikke krever et kommentert grunnsannhetsdatasett for opplæring. Simuleringen starter med geometrigenerering ved hjelp av parametriske kurver for formgenerering.
Emittere er jevnt fordelt og tilfeldig plassert på overflaten av den genererte formen slik at tettheten samsvarer med eksperimentelle verdier. En 3D PSF av mikroskopet beregnes ved hjelp av Gibson-Lanni-modellen. For å oppnå fotorealisme mellom de simulerte bildene og de eksperimentelle bildene, emulerer vi både mørke og skuddlyder.
Fysikkens grunnsannhet genereres i form av et binært kart. Vi vurderer effekten av CCCP-behandling på mitokondrienes morfologi av faste kardiommyoblaster avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Cellekultur.
Forbered deg på såing av cellene, som opererer i en steril laminær strømningshette, ved å plassere en dekkslipp for hver eksperimentell tilstand i en brønn på en 12-brønnplate. Forsikre deg om at den fortynnede cellesuspensjonen blandes riktig ved å pipettere innholdet i sentrifugerøret opp og ned flere ganger før du dispenserer riktig volum til hver brønn. Eksperimentell prosedyre.
Aspirer cellekulturmedier fra brønnene på 12-brønnplaten, og påfør deretter raskt ferske forvarmede medier til kontrollbrønnene og det forvarmede mediet med 10 mikromolar CCCP-løsning til testtilstandsbrønnene. Inkuber i 37 Celsius celleinkubatoren i to timer. Aspirer cellekulturmedier fra brønnene og påfør den forvarmede fikseringsløsningen.
Farging og montering av celler på dekkslipp. Legg 10 mikroliter monteringsmedier til et forberedt glassglass for å montere et deksel. Plukk opp dekselet slip fra 12 brønn plate med pinsett og dab fuktighet av dekselet slips ved kort å berøre kanten og baksiden av dekselet slip til forberedt lofri papirhåndkle.
Senk dekselet forsiktig ned på den ventende dråpen av monteringsmedier. Mikroskop og bildebehandling. Bruk okularene til å justere Z-nivået manuelt for å ha prøven i fokus.
Bytt til den anskaffede fanen i programvaren. Bruk smartoppsettet til å velge fluorescenskanal som skal brukes til bildebehandling. Array-sentrert på midten av dekselet slip med 12 totalt posisjoner som skal avbildes.
Posisjon RA sentrert på midten av dekselet slip. Det er mulig å avbilde flere steder på en automatisert måte. Generering av simulerte treningsdata.
Last ned koden og pakk ut innholdet. Følg instruksjonene og viktig-filen for å konfigurere miljøet. Naviger til mappen som heter src"Lag en kopi eller bruk mappen 2.
mitokondrier simulering luftig"og gi den nytt navn. Denne mappen inneholder alle filene relatert til simuleringen av treningsdataene. Det er tre sett med parametere som skal settes for simuleringen.
Først angir du parametrene for antall mitokondrier, diameterområde, Z-akseområde og tetthet av fluoroforer for simulatoren i batchkonfigurasjonsfilen. Deretter angir du optiske parametere med numerisk blenderåpning, forstørrelse og minimum bølgelengde for datasettet i filen microscopePSFmode. py"Angi ønsket verdi for pikselstørrelse og utslippsbølgelengde i brannen generate_batch_parallel.
py"Angi det tredje settet med parametere angående utgangsdatasettet, som størrelsen på utgangsbilder, antall fliser i hvert bilde og antall totale bilder i filen generate_batch_parallel. py"Kjør filen generate_batch_parallel. py"for å starte simuleringen.
For å få det endelige bildet, lag en kopi av mappen som heter 5. Dataforberedelse og opplæring/dataforberedelse"og naviger inn i den. Angi parametrene for batchnummer og antall bilder per batch, støyområde som skal legges til i filen Data_generator.
py"Kjør filen Data_generator. py"lage montasjebildene. Kopier mappene med navnet image"and segment"inn i datatrain/train"-mappen.
Dyp læring basert segmentering. For å trene segmenteringsmodellen for en ny mikroskopbildeinnstilling, naviger til mappen som heter tog"og angi parametrene for bach-størrelse, ryggradsmodell for segmentering, antall epoker og læringshastighet for trening i filen som heter train_unet. py"Kjør filen train_unet.
py"for å starte treningen. Opplæringsprosessen viser beregningen for evaluering av segmenteringsmodellen på det simulerte valideringssettet. Når opplæringen er fullført, lagres modellen som best_model.
h5"i mappen som heter tog"For å teste modellen på mikroskopbildene, må bildene deles til den størrelsen som togmodellen ønsker. For dette, naviger til mappen som heter 6. Forbered testdata"og kopier PNG-formatfilene til dataene til mappen PNG"og kjør filen split_1024_256.
py"Dette vil skape 256 x 256 størrelse avlinger av bildene i datamappen. For å segmentere bildeavlinger, gå til mappen som heter 7. Test segmentering"og kjør filen som heter segment.
py"etter å ha angitt navnet på den lagrede modellen som skal brukes. De segmenterte bildene lagres i utdatamappen. Morfologisk analyse.
Plasser filen med navnet make_montage. py"inn i mappen som heter 7. Test segmentering"og kjør filen for å sy den segmenterte utgangen tilbake til den opprinnelige størrelsen på bildet.
Opprett en ny mappe med navnet 9. Morfologisk analyse"i kildemappen og naviger inn i den. Installer skan- og seaborn-bibliotekene ved hjelp av kommandoen pip install seaborn skan"Segmenteringsmaskene er skeletonized ved hjelp av biblioteket som heter skan"for å muliggjøre analyse av topologien til den enkelte mitokondrion.
Plasser filen i mappen 9. Morfologisk analyse"Ordne bildene av forskjellige grupper av eksperimentet i forskjellige mapper inne i mappen 7. Testsegmentering"Kjør filen for å lage plott for analysen. Resultater.
Den kvantitative analysen som skal utføres, avhenger av forskningsspørsmålene eller hypotesen. I vårt eksperiment var vi interessert i de tre forskjellige morfologiene til mitokondrier, nemlig prikker"små mitokondrierbiter, stenger"fiberlignende eller streng som mitokondrier og flergrenede nettverk"For å identifisere morfologien skeletoniserer vi først segmenteringsutgangen og analyserer grenkoblingene til de forskjellige klassene. Vi viser resultatene av analysen for de to gruppene av galaktosetilpassede celler, kontrollgruppen og CCCP-behandlede gruppen.
Vi ser en betydelig økning i gjennomsnittlige grenlengder av prikker, noe som forventes, gitt de svulmende mitokondriene gjennomgår når de blir utsatt for CCCP. Prosentandelen mitokondrier i individuelle lengder av både stenger og nettverksklasser reduseres betydelig i forhold til kontrollen når cellene er behandlet med CCCP, og bekrefter dermed hypotesen vår. Et utfordrende scenario for vår metode er når bildet har tettpakkede mitokondrier.
Den rosa fargen indikerer den lengste enkelt mitokondrion som er oppdaget i bildet, noe som skyldes den økte feilen i segmenteringsresultatene. Disse feiltilfellene kan oppdages ved kontroll av lengdene av mitokondrier og ved bruk av morfologiske operatører. Mens vår anvendelse er et eksempel på hvordan vi utførte analyse av mitokondriell morfologi, tror vi at en slik analyse og forskningsspørsmål rundt den kan formuleres for ulike aspekter av mitofagi og relaterte biologiske eksperimenter.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
