This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Анализ митохондриальной морфологии с помощью моделирования контролируемого обучения
Chapters
Summary March 3rd, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
В этой статье объясняется, как использовать машинное обучение под наблюдением моделирования для анализа морфологии митохондрий во флуоресцентных микроскопических изображениях фиксированных клеток.
Transcript
Мы демонстрируем использование инструмента машинного обучения под наблюдением моделирования для анализа митохондрий в флуоресцентных микроскопических изображениях фиксированных клеток. Современные методы сегментации митохондрий в микроскопических изображениях включают автоматические методы на основе пороговых значений, такие как Ostu или ручная сегментация. Методы, основанные на пороговых значениях, работают плохо там, где отношение сигнала к фону низкое.
Как правило, изображения для морфологического анализа имеют большое количество митохондрий, что делает ручную сегментацию утомительной. Контролируемые методы глубокого обучения выполняют сегментацию с высокой точностью, но требуют большого количества входных данных пары земля-истина для обучения. Этот подход использует симулятор на основе физики для создания пар микроскопических изображений и их 2D-маски наземной истины, что устраняет необходимость в ручной аннотации.
Модель, обученная на смоделированных изображениях, затем используется для сегментации митохондрий в реальных микроскопических изображениях. Мы используем инструмент сегментации на основе глубокого обучения, который позволяет автоматизировать эту задачу с высокой точностью и не требует аннотированного набора данных наземной правды для обучения. Моделирование начинается с генерации геометрии с использованием параметрических кривых для генерации фигур.
Излучатели равномерно распределены и случайным образом размещены на поверхности генерируемой формы таким образом, чтобы плотность соответствовала экспериментальным значениям. 3D PSF микроскопа вычисляется с использованием модели Гибсона-Ланни. Чтобы достичь фотореализма между смоделированными изображениями и экспериментальными изображениями, мы эмулируем как темные, так и снятые шумы.
Физическая основа-истина генерируется в виде двоичной карты. Мы оцениваем влияние лечения CCCP на морфологию митохондрий фиксированных кардиоммиобластов, визуализированных с помощью конфокального микроскопа. Клеточная культура.
Подготовьтесь к посеву клеток, работающих в стерильной ламинарной вытяжке, поместив крышку для каждого экспериментального состояния в колодец из 12-луночной пластины. Убедитесь, что разбавленная клеточная суспензия правильно перемешана, пипетируя содержимое трубки центрифуги вверх и вниз несколько раз, прежде чем дозировать соответствующий объем в каждую лунку. Экспериментальная процедура.
Аспирировать среду клеточных культур из скважин пластины 12 скважин затем быстро наносить свежую предварительно нагретую среду в контрольные скважины и предварительно нагретую среду с 10 микромолярным раствором CCCP в испытательное состояние скважин. Инкубируйте в клеточном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Аспирировать культуральную среду клеток из скважин и применять предварительно нагретый фиксирующий раствор.
Окрашивание и крепление ячеек на крышках. Добавьте 10 микролитровых монтажных носителей к подготовленному стеклянному слайду для крепления крышки. Поднимите крышку с 12-луночной пластины с помощью пинцета и смахните влагу со скольжения крышки, ненадолго коснувшись края, а задняя часть крышки скользит к подготовленному бумажному полотенцу без ворса.
Осторожно опустите крышку вниз на ожидающую каплю монтажного носителя. Микроскоп и визуализация. Используя окуляры, вручную отрегулируйте уровень Z, чтобы образец был в фокусе.
Переключитесь на приобретенную вкладку в программном обеспечении. Используйте интеллектуальную настройку для выбора флуоресцентного канала, который будет использоваться для визуализации. Массив с центром в середине крышки с 12 позициями для изображения.
Положение RA центрировано по центру скольжения крышки. Можно автоматически отображать несколько мест. Создание смоделированных обучающих данных.
Загрузите код и распакуйте содержимое. Следуйте инструкциям и файлу readme для настройки среды. Перейдите в папку с именем src"Сделайте копию или используйте папку 2.
симуляция митохондрий воздушная» и переименовать его. Эта папка содержит все файлы, связанные с моделированием обучающих данных. Для моделирования необходимо задать три набора параметров.
Сначала задайте параметры количества митохондрий, диапазона диаметра, диапазона оси Z и плотности флуорофоров для симулятора в пакетном конфигурационном файле. Далее задают оптические параметры числовой апертуры, увеличения и минимальной длины волны набора данных в файловом микроскопеPSFmode. py"Установите требуемое значение для размера пикселя и длины волны излучения в generate_batch_parallel огня.
py"Задайте третий набор параметров для выходного набора данных, таких как размер выходных изображений, количество плиток в каждом изображении и общее количество изображений в файле generate_batch_parallel. py"Запустите файл generate_batch_parallel. py", чтобы начать моделирование.
Чтобы получить изображение окончательного размера, создайте копию папки с именем 5. Подготовка данных и обучение/подготовка данных» и переходите в него. Задайте параметры номера пакета и количество изображений в пакете, диапазон шумов, добавляемых в файл Data_generator.
py"Запустите файл Data_generator. py" создают монтажные изображения. Скопируйте папки с именем image" и segment" в папку datatrain/train".
Сегментация на основе глубокого обучения. Для обучения модели сегментации для новой настройки изображения микроскопа перейдите в папку с именем train" и задайте параметры размера баха, магистральной модели для сегментации, количества эпох и скорости обучения внутри файла с именем train_unet. py"Запустите файл train_unet.
py", чтобы начать обучение. В процессе обучения отображается метрика для оценки модели сегментации в моделируемом наборе проверок. После завершения обучения модель сохраняется как best_model.
h5" в папке с именем train"Чтобы проверить модель на изображениях микроскопа, изображения должны быть разделены до размера, желаемого моделью поезда. Для этого перейдите в папку с именем 6. Подготовьте тестовые данные" и скопируйте файлы данных формата PNG в папку PNG" и запустите файл split_1024_256.
py"Это создаст обрезки изображений размером 256 на 256 в папке данных. Чтобы сегментировать обрезки изображений, перейдите в папку с именем 7. Проверка сегментации" и запустите файл с именем segment.
py" после установки имени сохраненной модели для использования. Сегментированные изображения сохраняются в выходную папку. Морфологический анализ.
Поместите файл с именем make_montage. py" в папку с именем 7. Проверьте сегментацию» и запустите файл, чтобы сшить сегментированные выходные данные обратно к исходному размеру изображения.
Создайте новую папку с именем 9. Морфологический анализ» в исходной папке и перейдите в нее. Установите библиотеки skan и seaborn с помощью команды pip install seaborn skan"Маски сегментации скелетируются с помощью библиотеки skan", чтобы можно было анализировать топологию отдельных митохондрий.
Поместите файл в папку 9. Морфологический анализ»Упорядочить изображения разных групп эксперимента в разные папки внутри папки 7. Тестовая сегментация"Запустите файл для создания графиков для анализа. Результаты.
Количественный анализ, который должен быть выполнен, зависит от вопросов исследования или гипотезы. В нашем эксперименте нас интересовали три различные морфологии митохондрий, а именно точечные «маленькие биты митохондрий», палочки, похожие на волокна или струнные митохондрии, и многоветвистые сети» Чтобы идентифицировать морфологию, мы сначала скелетируем выход сегментации и анализируем ветвистые звенья различных классов. Показаны результаты анализа для двух групп клеток, адаптированных к галактозам, контрольной группы и группы, получавшей КЦКП.
Мы видим значительное увеличение средней длины ветвей точек, что ожидается, учитывая набухание митохондрий при воздействии CCCP. Процент митохондрий в отдельных длинах как стержней, так и сетевых классов значительно снижается по сравнению с контролем, когда клетки были обработаны CCCP, что подтверждает нашу гипотезу. Сложный сценарий для нашего метода — когда изображение имеет плотно упакованные митохондрии.
Розовый цвет указывает на самую длинную одиночную митохондрию, обнаруженную на изображении, что вызвано повышенной погрешностью в результатах сегментации. Эти случаи сбоя могут быть обнаружены путем контроля длин митохондрий и использования морфологических операторов. Хотя наше приложение является примером того, как мы проводили анализ митохондриальной морфологии, мы считаем, что такой анализ и исследовательские вопросы вокруг него могут быть сформулированы для различных аспектов митофагии и связанных с ней биологических экспериментов.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
