This content is Free Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analysera mitokondriell morfologi genom simulering övervakat lärande
Chapters
Summary March 3rd, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den här artikeln förklarar hur man använder simuleringsövervakad maskininlärning för att analysera mitokondrimorfologi i fluorescensmikroskopibilder av fasta celler.
Transcript
Vi demonstrerar användningen av ett simuleringsövervakat maskininlärningsverktyg för att analysera mitokondrier i fluorescerande mikroskopibilder av fasta celler. Nuvarande metoder för att segmentera mitokondrier i mikroskopibilder inkluderar automatiska tröskelbaserade metoder som Ostu eller manuell segmentering. Tröskelbaserade tekniker fungerar dåligt där förhållandet mellan signal och bakgrund är lågt.
Vanligtvis har bilder för den morfologiska analysen ett stort antal mitokondrier, vilket gör manuell segmentering tråkig. Övervakade djupinlärningsmetoder utför segmentering med hög noggrannhet, men kräver ett stort antal indata för mark-sanningspar för träning. Detta tillvägagångssätt använder en fysikbaserad simulator för att generera par mikroskopibilder och deras 2D-marksanningsformmask, vilket eliminerar behovet av manuell anteckning.
Modellen som tränats på simulerade bilder används sedan för att segmentera mitokondrier i riktiga mikroskopbilder. Vi använder ett djupinlärningsbaserat segmenteringsverktyg som möjliggör automatisering av den här uppgiften med hög noggrannhet och som inte kräver en kommenterad ground-truth-datauppsättning för träning. Simuleringen börjar med geometrigenereringen med hjälp av parametriska kurvor för formgenerering.
Emittrar fördelas jämnt och placeras slumpmässigt på ytan av den genererade formen så att densiteten matchar experimentella värden. En 3D PSF av mikroskopet beräknas med hjälp av Gibson-Lanni-modellen. För att uppnå fotorealism mellan de simulerade bilderna och de experimentella bilderna efterliknar vi både mörker och skottljud.
Fysikens grundsanning genereras i form av en binär karta. Vi bedömer effekten av CCCP-behandling på mitokondrimorfologi hos fasta kardiommyoblaster avbildade med hjälp av ett konfokalmikroskop. Cellodling.
Förbered dig på sådd av cellerna, som arbetar i en steril laminär flödeshuv, genom att placera en täckglidning för varje experimentellt tillstånd i en brunn på en 12-brunnsplatta. Se till att den utspädda cellsuspensionen är ordentligt blandad genom att pipettera innehållet i centrifugröret upp och ner flera gånger innan lämplig volym tillförs varje brunn. Experimentellt förfarande.
Aspirera cellodlingsmedier från brunnarna på 12-brunnsplattan och applicera sedan snabbt färska förvärmda medier på kontrollbrunnarna och det förvärmda mediet med 10 mikromolar CCCP-lösning på testförhållandenas brunnar. Inkubera i 37 Celsius cellinkubatorn i två timmar. Aspirera cellodlingsmedier från brunnarna och applicera den förvärmda fixeringslösningen.
Färgning och montering av celler på lockglidningar. Tillsätt 10 mikroliter monteringsmedia till en förberedd glasskiva för att montera en täckglidning. Plocka upp täckbladet från 12-brunnsplattan med pincett och dutta bort fukt från lockets glidningar genom att kort röra kanten och baksidan av locket glida till den förberedda luddfria pappershandduken.
Sänk försiktigt ner locket på den väntande droppen av monteringsmedia. Mikroskop och avbildning. Använd kikaren och justera Z-nivån manuellt så att provet är i fokus.
Byt till den förvärvade fliken i programvaran. Använd den smarta inställningen för att välja fluorescenskanal som ska användas för avbildning. Array-centrerad på mitten av omslagsglidningen med totalt 12 positioner som ska avbildas.
Placera RA centrerat på mitten av lockglidningen. Det är möjligt att avbilda flera platser på ett automatiserat sätt. Generera simulerade träningsdata.
Ladda ner koden och packa upp innehållet. Följ instruktionerna och viktigt-filen för att konfigurera miljön. Navigera till mappen som heter src"Gör en kopia eller använd mappen 2.
mitokondrier simulering luftig"och byt namn på den. Den här mappen innehåller alla filer som är relaterade till simuleringen av träningsdata. Det finns tre uppsättningar parametrar som ska ställas in för simuleringen.
Ställ först in parametrarna för antal mitokondrier, diameterintervall, Z-axelintervall och densitet av fluoroforer för simulatorn i batchkonfigurationsfilen. Ange sedan optiska parametrar för numerisk bländare, förstoring och minsta våglängd för datauppsättningen i filmikroskopetPSFmode. py"Ställ in önskat värde för pixelstorlek och emissionsvåglängd i branden generate_batch_parallel.
py"Ställ in den tredje uppsättningen parametrar för utdatauppsättningen, som storleken på utdatabilder, antalet paneler i varje bild och antalet totala bilder i filen generate_batch_parallel. py"Kör filen generate_batch_parallel. py"för att starta simuleringen.
För att få den slutliga bilden, gör en kopia av mappen med namnet 5. Dataförberedelse och träning/dataförberedelse"och navigera in i den. Ställ in parametrarna för batchnummer och antalet bilder per sats, brusintervall som ska läggas till i filen Data_generator.
py"Kör filen Data_generator. py"skapa montagebilderna. Kopiera mapparna med namnet image"och segment"till mappen datatrain/train".
Djupinlärningsbaserad segmentering. Om du vill träna segmenteringsmodellen för en ny inställning för mikroskopbild navigerar du till mappen med namnet train" och anger parametrarna för bach-storlek, stamnätsmodell för segmenteringen, antalet epoker och inlärningshastighet för träning i filen med namnet train_unet. py"Kör filen train_unet.
py"för att starta träningen. Träningsprocessen visar måttet för att utvärdera segmenteringsmodellen på den simulerade valideringsuppsättningen. När träningen är klar sparas modellen som best_model.
h5"i mappen med namnet train"För att testa modellen på mikroskopbilderna måste bilderna delas upp till den storlek som är önskvärd av tågmodellen. För detta navigerar du till mappen med namnet 6. Förbered testdata"och kopiera PNG-formatfilerna för data till mappen PNG"och kör filen split_1024_256.
py"Detta skapar 256 x 256 storleksgrödor av bilderna i datamappen. För att segmentera bildgrödor, gå till mappen som heter 7. Testa segmentering"och kör filen med namnet segment.
py"efter att ha ställt in namnet på den sparade modellen som ska användas. De segmenterade bilderna sparas i utdatamappen. Morfologisk analys.
Placera filen med namnet make_montage. py"i mappen som heter 7. Testa segmentering"och kör filen för att sammanfoga de segmenterade utdata tillbaka till bildens ursprungliga storlek.
Skapa en ny mapp med namnet 9. Morfologisk analys"i källmappen och navigera in i den. Installera skan- och seaborn-biblioteken med kommandot pip install seaborn skan"Segmenteringsmaskerna skelettiseras med hjälp av biblioteket med namnet skan"för att möjliggöra analys av topologin för den enskilda mitokondrion.
Placera filen i mappen 9. Morfologisk analys"Ordna bilderna av olika grupper av experimentet i olika mappar i mappen 7. Testsegmentering"Kör filen för att skapa diagram för analysen. Resultat.
Den kvantitativa analysen som ska utföras beror på forskningsfrågorna eller hypotesen. I vårt experiment var vi intresserade av mitokondriernas tre olika morfologier, nämligen prickar"små mitokondrierbitar, stavar"fiberliknande eller sträng som mitokondrier och flergrenade nätverk"För att identifiera morfologin skelettiserar vi först segmenteringsutgången och analyserar grenlänkarna för de olika klasserna. Vi visar resultaten av analysen för de två grupperna av galaktosanpassade celler, kontrollgruppen och den CCCP-behandlade gruppen.
Vi ser en signifikant ökning av de genomsnittliga grenlängderna på prickar, vilket förväntas, med tanke på den svullnad mitokondrier genomgår när de utsätts för CCCP. Andelen mitokondrier i individuella längder av både stavar och nätverksklasser reduceras signifikant i förhållande till kontrollen när cellerna har behandlats med CCCP, vilket verifierar vår hypotes. Ett utmanande scenario för vår metod är när bilden har tätt packade mitokondrier.
Den rosa färgen indikerar den längsta enskilda mitokondrion som upptäckts i bilden, vilket orsakas på grund av det ökade felet i segmenteringsresultaten. Dessa felfall kan detekteras genom en kontroll av mitokondriernas längder och med hjälp av morfologiska operatorer. Medan vår ansökan är ett exempel på hur vi utförde analys av mitokondriell morfologi, tror vi att en sådan analys och forskningsfrågor kring den kan formuleras för olika aspekter av mitophagi och relaterade biologiska experiment.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
