Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

Qitao Zhang; Gillian Autterson; Jason  M. L. Miller

doi:10.3791/65242

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Biology

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高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

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Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

高度に分極されたヒト網膜色素上皮培養におけるリポフスチンモデルの改善と外セグメント食能力の定量化

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10:39 min

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April 14, 2023

DOI:

10.3791/65242-v

DOI:

10.3791/65242-v

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10:39 min

April 14, 2023

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Qitao Zhang¹, Gillian Autterson¹, Jason M. L. Miller^1,2

¹Kellogg Eye Center,University of Michigan, Ann Arbor, ²Cellular and Molecular Biology Program,University of Michigan, Ann Arbor

Transcript

リポフスチンは加齢とともにRPEに普遍的に蓄積しますが、その毒性を識別することは困難でした。ここでは、高度に分極された成熟したRPE培養でリポフスチン様蓄積を発生させて、RPE生理学に対するリポフスチンの影響を識別するのに役立つプロトコルを開発します。ヒトにおけるリポフスチン毒性の研究は、RPEが死ぬにつれてリポフスチンが減少するという事実によって交絡している。

リポフスチン毒性の動物モデルは、広く異なる結果をもたらしました。リポフスチン毒性の研究を容易にするために、リポフスチン様物質蓄積のin vitroモデルを慎重に作成しました。私たちのモデルの成功の鍵は、高度に分化した培養を維持しながら、in vivoでリポフスチンをトリガーするのと同じプロセス、つまり光受容体外節の食作用を介してリポフスチン発生を誘導することです。

当社のin vitroプロトコルは、リポフスチン様物質が高度に分化したRPE培養物に蓄積し、in vivoでRPEを忠実に模倣するという点で独特です。このような状況において、RPE培養はリポフスチン蓄積およびリポフスチンによる毒性作用に対して高い耐性を有することを見出した。さらに、RPE培養におけるリポフスチン様蓄積によって誘導される表現型をアッセイする過程で、総消費能力と呼ばれる新しいタイプの食作用アッセイを作成しました。

このアッセイにより、古典的なパルスチェイス食作用アッセイに伴う交絡解釈の一部を回避しながら、外側セグメントを食作用させるRPEの全能力を決定することができます。リポフスチン様物質蓄積のこのモデルを利用して、RPEストレッサーが通常不活性なリポフスチンをRPE細胞死においてより病理学的な役割に取り込む可能性があることをよりよく理解できることを嬉しく思います。

Summary

このプロトコルでは、高度に分化および分極されたヒト網膜色素上皮(RPE)培養におけるリポフスチン蓄積モデルと、RPEの総OS消費/分解能力を検出するための改良された外部セグメント(OS)食作用アッセイについて説明します。これらの方法は、以前のリポフスチンモデルおよび古典的なパルスチェイス外セグメント食作用アッセイの限界を克服します。