在鸡胚神经诱导的含量为

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

神经诱导是在大脑形成的第一步。它是一种机制,使恒胜的节点(组织者),指示相邻的组织采用了神经的命运,即会引起神经系统。本视频演示了在鸡胚神经诱导实验。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Psychoyos, D., Finnell, R. Assay for Neural Induction in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (24), e1027, doi:10.3791/1027 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

鸡胚是一个有价值的工具,在早期胚胎发育的研究。其透明度,可获得性和易于操纵,使其为研究神经系统的形成和最初的图案的理想工具。本视频演示了如何移植到主机组织者组织,恒胜小号节点的方法是,(在鸡胚的组织者)被嫁接到一个主机主管外胚层。主办移植指示覆NA已经组织采取通过神经诱导信号的神经命运。这一机制被称为神经诱导,并构成了脊椎动物的大脑和脊髓的形成初始步骤。这种方法实质上是公认的在小鸡的神经诱导分子的特性。本视频演示了在神经诱导实验的不同步骤,首先,德纳胚胎explanted和寄托一道菜。然后,主机胚胎准备为新的文化。移植是切除和移植到主机领域的透明带保证金。主机是培养18-22小时。大会是固定的,为进一步应用(例如原位杂交)处理。这种方法最初设计由沃丁顿

Protocol

一,原理概述:

图1

本视频演示了在不同的步骤检测在鸡胚神经诱导。首先,主机的胚胎是explanted在新的文化[NI1]。然后,德纳胚胎是在生理盐水和恒胜的节点(在鸡的“组织者”)explanted与荧光染料DII标记[NI2]。恒胜的节点是从德纳胚胎切除[NI3]和主机的胚胎移植到[NI4,NI5]。主机的胚胎,然后长达22小时,培养后,期间德纳组织诱导异位轴在主机领域opaca [NI6]。 [网联科技]以下文化,主机胚胎是固定的,民建联存在的光氧化处理:通过这种化学反应,德纳源性细胞,FITC荧光下出现红色光氧化[NI7前,变成褐色与民建联以下反应。原位杂交胚胎处理与神经标记[网联科技];主机派生组织已形成存在德纳移植神经组织。这个组织显示为蓝色。

1:准备新的文化的主机的胚胎

  1. 这一神经诱导实验协议,已培养汉堡和汉密尔顿第3阶段的鸡蛋开始 +(或HH3) 。这些鸡蛋已经奠定了他们一边在一个潮湿的孵化器孵育13小时。
  2. 准备新的文化(步骤3.1至5.5 9)主机胚胎。
  3. 主机胚胎表面覆盖200μL生理盐水。这将有利于以后的转移和定位德纳移植。
  4. 最后,盖一个倒置的猎鹰35毫米培养皿大会。

2:Explanting德纳胚胎在盐水

  1. 打开攻壳钳和删除所有周围的壳壳件,蛋。拆下外壳的顶部和丢弃。
  2. 删除与钳厚白蛋白,粗钳倾斜卵黄囊使胚胎朝上。
  3. 用细剪刀,切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。从蛋黄用勺子取出胚胎,并在含有PBS菜的地方。
  4. 使用镊子,从区带分离德纳胚胎。
  5. 德纳胚胎转移到Sylgard盖菜含有PBS。

3:标签,切除和移植德纳移植

  1. 使用微电极拉马,拉50μL玻璃microcapillary移液器。在显微镜下,削减微量用细镊子的尖端。放置在培养皿中的微管内衬的plasteline剪彩。
  2. 准备染料溶液,将被用于标签移植前移植:carbocyanine染料DII(1,1' - 双十八烷基- 3,3,3',3' - tetramethylindocarbocyanine高氯酸盐):首先,准备在1毫升一个DII股票在0.5%的无水乙醇。这个股票可以被存储在- 20C在黑暗中。在水浴42℃,混合预热40μLDII股票360μl0.3M蔗糖。水浴温度是必要的,以防止DII和形成不溶性晶体的沉淀。简要自旋对一个小型spectrafuge的解决方案(5-10秒)。 DII的解决方案现在已经可以使用。
  3. 使用驱虫针,安全德纳胚胎Sylgard盖菜的底部。
  4. 回到填补DII微量。通过运用柔和的压力使用吸引器管组装,适用于小的DII丸恒胜的节点。确保整个恒胜的节点标记。
  5. 使用microcapillary吸管或microdissecting刀,切恒胜的节点(“组织者”,德纳移植)。
  6. 标记的腹侧和胭脂红移植后结束。这将确保移植是适当的步骤4.3背腹方向定位。
  7. 使用200μL吉尔森移液器,转让主机胚胎移植。

4:保护主机胚胎移植和培养

  1. 从主机胚胎中取出生理盐水,确保移植仍然定位在与主持人现场靠近。
  2. 使用microcapillary吸管或microdissecting刀,在该地区的透明带/地区opaca边界地区的一个小切口(80 -100μm的),在恒胜的节点主机胚胎水平。
  3. 使用一个microcapillary吸管或microdissecting刀,位置嫁接,使腹侧方对你和后部面临的是平行的主机胚胎相当于地区。
  4. 去除剩余的生理盐水,并处理81-22小时(步骤6.1至6.6 9)为新的文化的主机胚胎。
  5. 主机的胚胎,然后在4 ° C(7.1至7.7 9步骤)固定过夜。
E“> 5:Photooxidise荧光下的移植

  1. 通风柜下,准备一个DAB工作液:Tris缓冲液溶解民建联基板(3,3' - 二氨基tetrahydrochloride)在500μg/ml的Tris缓冲液(100MM的Tris - HCl,pH值7.4);保持在黑暗的解决方案,在冰上,。
  2. 胚胎洗5分钟,两次在PBS每一次在Tris缓冲液为5分钟。
  3. 将胚胎含有Tris缓冲液1毫升的玻璃腔幻灯片。
  4. 更换Tris缓冲液,用1.5毫升民建联溶液。处理的Eppendorf提示中含有10%的漂白粉溶液,以净化民建联桶。将盖玻片上腔幻灯片的顶部。
  5. FITC(异硫氰酸荧光素)的荧光下,专注于移植(德纳细胞会出现红色荧光)显微镜的目标,直到所有的红色荧光细胞变成褐色(这DII的结果发生,暴露FITC荧光的荧光被photoconverted不溶性的棕色晶体,曝光FITC的激发波长(488nm)在民建联存在。,这个过程需要20分钟和2小时之间。
  6. 氧化反应完成后,用细镊子取出盖玻片。胚胎转移到玻璃20毫升闪烁瓶中,含PBTw(或0.1%Tween - 20的PBS)。
  7. 从盖玻片和玻璃腔滑停用民建联在10%的漂白粉溶液孵化。

6:处理的胚胎在原位杂交技术,摄影和切片

  1. 继续进行原位杂交(步骤3.7至6.5 9),孵化的胚胎只辛标记探针。
  2. 继续拍摄(步骤8.2 9)和切片(8.3和8.4 9步骤)。

代表性的成果

在下面的例子神经诱导实验,德纳移植诱导表达从主机派生组织的神经标记无尾。在这个特殊的例子中,我们评估收购胚胎地区一般不会有“组织者”的能力的神经诱导能力:德纳移植在其中的“组织者”的地区已经从德纳胚胎手术去除阶段的胚胎起源3 +德纳胚胎以下消融,是允许在新的文化发展,直到洞已愈合,并已形成一个结构类似恒胜的节点。这种结构与DII标记,从德纳胚胎切除,嫁接面积透明带/地区opaca主机胚胎的边界。新的文化,形成一个微型轴相邻主机胚胎:这种微型轴组成的红细胞杆(德纳派生)和一个头状结构(主机派生):在(a),德纳衍生DiI标记FITC荧光显微镜下,细胞内固定前。这些德纳源性细胞增殖,形成一个微型的脊索,出现红细胞杆。 (二)以下光转​​化DII,这些德纳源性细胞出现棕黄色。 [转载]从6德纳移植诱导的神经组织形成从主机,这个组织包括大脑前体,因为它们的表达显示标记原位杂交无尾以下。

图2

注:在此过程中,我们用DiI标记的细胞,以区别于神经诱导德纳组织(红色/棕色)派生的“神经元”的组织(蓝色)的主机。而不是使用小鸡派生,DiI标记德纳移植,有些作者还使用德纳从鹌鹑胚胎,而不是小鸡的组织[如6]。这种替代的方法也可以让宿主组织,以区别于德纳。在这种情况下,移植(德纳组织)源于鹌鹑蛋代替​​鸡蛋。从协议中省略以下步骤4.5,主机是与特定的抗体,鹌鹑组织(QCP1)和步骤3.1到3.4和5.1至5.7整装免疫组织化学处理。这种替代过程中的一个例子如下所示:在这种情况下,我们使用相同的实验程序,在A,B,但我们用鹌鹑衍生德纳组织(表达QCPN抗体[棕色]所示):再生从鹌鹑胚胎衍生的节点,引起泛神经标记Sox2基因在宿主的表达[转载]从6:

图3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

本视频演示了不同的步骤执行检测神经诱导,这种检测基本上是公认的在小鸡的神经诱导分子的特性,因此可以使用一个广泛的应用, 范围胚胎 micromanipulations 1-4,; 6日至揭开新的信号级联反应,7,8,所有旨在了解初步形成大脑和神经系统的其余步骤。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

DP是从国家药物滥用研究所露丝Kirschstein奖1F32 DA021977 - 01A1收件人。这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile Fertilized, HH3+ (14 hr)
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5 or similar
Hybridization Incubator Equipment Robbins Scientific, SciGene M1000 Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker
Marsh Automatic Incubator Equipment Lyon RX
Pyrex dish
Watchmaker’s glass 50mm Tool VWR international 66112-060
Glass rings Tool Physical Plant facility cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish.
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Forceps (2) Tool Fine Science Tools 11002-13 blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Plastic dishes Tool Falcon BD 353001
Rubber Bulb Tool Electron Microscopy Sciences 70980
DiI Reagent Invitrogen D-282
Aspirator tube assembly Tool Sigma-Aldrich A5177-5EA
Micr–lectrode puller Equipment Sutter Instrument Co. Sutter InstrumentsP-97 Flaming/Brown Micropipette
Pasteur Capillary Pipette Tool Electron Microscopy Sciences 70950-12 round edge under flame
Culture chamber Tool Pioneer Plastics 030C
Microcapillary tube Tool Sigma-Aldrich P1049-1PAK
Microdissecting knife Tool Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Tool Fine Science Tools 26002-20 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Electron Microscopy Sciences 15710

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
  2. Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
  3. Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
  4. Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. 149-180 (1971).
  5. Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. 605-612 (1990).
  6. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. 3263-3273 (1996).
  7. Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
  8. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406-474 (2000).
  9. Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics