GentleMACS Dissociator के साथ सिंगल सेल माउस प्लीहा से निलंबन की तैयारी

Biology
 

Summary

यह वीडियो स्वचालित ऊतक gentleMACS Dissociator का उपयोग करने के लिए माउस splenocytes एकल कक्ष निलंबन तैयार हदबंदी के लिए एक सरल, समय की बचत तकनीक का वर्णन करता है.

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Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029, doi:10.3791/1029 (2008).

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Abstract

एकल कक्ष निलंबन सेल जुदाई, सेल विश्लेषण और सेल संस्कृति में प्रयोगों के लिए एक शर्त है. थकाऊ और अक्सर दर्दनाक पुस्तिका dissociations से बचने gentleMACS Dissociator एक ऊतक अलग कर देना करने के लिए नियंत्रित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य शर्तों के तहत बहुत कुशलता से की अनुमति देता है. gentleMACS Dissociator बेहतर माउस तिल्ली अलग कर देना, कर सकते हैं उपयोगकर्ता सुरक्षा के साथ timesaving और मानकीकरण के संयोजन. यह वीडियो बताता है कि कैसे माउस spleens gentleMACS Dissociator, एक स्वचालित उपकरण पीठ टॉप कि यंत्रवत् विशेष ट्यूबों का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य सेल निलंबन उत्पादन के ऊतकों को बाधित कर सकते हैं का उपयोग कर अलग कर देना करने के लिए. हदबंदी के बाद, spleens फ़िल्टर्ड रहे हैं, centrifuged, और अधिक अनुप्रयोगों के लिए resuspended.

Protocol

उपकरणों के लिए परिचय

  1. ऊतक धीरे अलग है, व्यवहार्य एकल कक्ष निलंबन में बैंगनी सी ट्यूब का उपयोग कर.
  2. पीबीएस / BSA EDTA बफर कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बफर BSA स्टॉक EDTA युक्त समाधान Rinsing autoMACS के 20 भागों के लिए समाधान के भाग 1 को जोड़कर तैयार है.
  3. एमएसीएस पूर्व पृथक्करण फ़िल्टर इतनी उपयोग किया जाता है कि अलग ऊतकों के नमूनों सभी सेल clumps के लिए स्वतंत्र हैं, सफल एमएसीएस जुदाई और बाद में विश्लेषण को बढ़ावा देने.

तिल्ली कोशिकाओं को अलग

  1. साबुत spleens gentleMACS Dissociator का उपयोग splenocytes की एकल कोशिका निलंबन में disscociated हैं.
  2. प्रक्रिया शुरू करने के लिए, के लिए बफर का एक मात्रा के साथ spleens के द्रव्यमान के अनुसार सी ट्यूब लोड. एक युवा वयस्क महिला माउस / BALB ग के एक स्वस्थ तिल्ली के बारे में 80-120 मिलीग्राम वजन. इस मास के हर 1 से 2 spleens बफर के 3 एमएल की आवश्यकता है. पुराने संक्रमण के साथ जानवरों या जानवरों से Spleens अक्सर बड़े और बफर में तौला जाना चाहिए. बफर मात्रा के अनुसार बढ़ाया जाना चाहिए. 10 एमएल की कुल बफर मात्रा से अधिक मत करो.
  3. सी बफर के 3 मिलीलीटर युक्त ट्यूब dissected तिल्ली जोड़ें.
  4. सुनिश्चित करें कि सी ट्यूब टोपी तंग है और dissociator टोपी के साथ सी ट्यूब के नीचे देते हैं.
  5. Dissociator अप पावर. 1-2 spleens के लिए, प्रोग्राम m_spleen_01 का चयन करें. कार्यक्रम 56 सेकंड लेने के लिए पूरा हो जाएगा. यदि spleens की संख्या अधिक है, m_spleen_04 कार्यक्रम का उपयोग करें, इस कार्यक्रम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता तिल्ली ऊतक के 720 मिलीग्राम है.
  6. कार्यक्रम की समाप्ति के बाद देशी तिल्ली ऊतक एक splenocyte निलंबन में अलग है.
  7. नीचे कमरे के तापमान पर के बारे में 30 सेकंड के लिए 300xg पर पूरे सेल निलंबन स्पिन. इससे यह सुनिश्चित होगा कि रोटर और stator सी ट्यूब के नीचे एकत्र कर रहे हैं सभी कोशिकाओं जो मुक्त कर रहे हैं.
  8. पट सी ट्यूब टोपी में सील खोलने 1000 microliter pipetter का उपयोग कर के माध्यम से नमूना निकालें.

निस्पंदन कदम

  1. निस्पंदन कदम शुरू करने के लिए, फ़िल्टर पूर्व पृथक्करण या 30 सुक्ष्ममापी ताकना आकार के साथ एक सेल झरनी dissociated ऊतक लागू होते हैं. झरनी 1-2 spleens या एक 50 एमएल ट्यूब के लिए अधिक से अधिक 2 spleens के लिए एक 15 एमएल ट्यूब फिट होना चाहिए.
  2. चलो सेल निलंबन के माध्यम से पारित. फिर बफर के 5 एमएल लागू करने के द्वारा फिल्टर धो लो.
  3. अब, 300xg सेल निलंबन के साथ ट्यूब, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए एक तिल्ली सेल गोली में सभी splenocytes एकत्र अपकेंद्रित्र.
  4. अब, कि हम dissociated splenocytes की एक गोली है, हम सतह पर तैरनेवाला aspirate और बफर का एक उचित मात्रा में गोली सेल resuspend चाहिए.

प्लीहा gentleMACS Dissociator का उपयोग हदबंदी व्यवहार्य splenocytes के एक उच्च प्रतिशत है, जो प्रवाह cytometry MACSQuant विश्लेषक का उपयोग द्वारा प्रदर्शन किया है निकलेगा. मृत कोशिकाओं propidium आयोडाइड से दाग रहे हैं. दिए गए उदाहरण में, आगे की ओर तितर बितर डॉट साजिश तैयार splenocytes से पता चलता है.

Discussion

थकाऊ और अक्सर दर्दनाक पुस्तिका dissociations से बचने के लिए, gentleMACS Dissociator एक ऊतक अलग कर देना करने के लिए नियंत्रित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य शर्तों के तहत बहुत कुशलता से की अनुमति देता है. ऊतक पृथक्करण प्रक्रिया और कोशिकाओं एक उच्च व्यवहार्यता दर के साथ पैदावार सेल निलंबन कोमल है. सी ट्यूब के साथ संयोजन में gentleMACS Dissociator विभिन्न ऊतकों से एकल कक्ष निलंबन की तैयारी के लिए डिज़ाइन किया गया है. साधन माउस, तिल्ली, जिगर, फेफड़े, या तंत्रिका ऊतक अलग कर देना के लिए पूर्व निर्धारित कार्यक्रमों की एक संख्या के साथ सुसज्जित है. कार्यक्रमों और प्रोटोकॉल की सीमा में लगातार हो अतिरिक्त ऊतकों को शामिल करने के लिए विस्तार किया जाएगा.

Disclosures

सभी प्रोटोकॉल और डेटा पत्रक पर उपलब्ध हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentleMACS™ Starting Kit Miltenyi Biotec 130-093-235 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes Miltenyi Biotec 130-093-237 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes Miltenyi Biotec 130-091-596 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters Miltenyi Biotec 130-041-407 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer Miltenyi Biotec 130-092-197
Propidium Iodide Solution Miltenyi Biotec 130-093-233 http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx

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Comments

2 Comments

  1. great

    Reply
    Posted by: somesh p.
    March 1, 2009 - 12:23 PM
  2. Hi, is this instrument only for spleen or can be used for some other tissues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 29, 2010 - 2:59 AM

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