Test de transition clair / foncé pour souris

Published 11/13/2006
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Biology
 

Summary

Le test de la transition jour / nuit est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement des souris. Ici, nous présentons un film qui montre des procédures détaillées sur la façon dont nous menons le test.

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Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark Transition Test for Mice. J. Vis. Exp. (1), e104, doi:10.3791/104 (2006).

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Abstract

Bien que toutes les séquences du génome de la souris ont été déterminés, nous ne savons pas encore les fonctions de la plupart de ces gènes. Gene-techniques de ciblage, cependant, peut être utilisé pour supprimer ou manipuler un gène spécifique chez la souris. L'influence d'un gène donné sur un comportement spécifique peut alors être déterminée par des analyses comportementales des souris mutantes. Comme un test de phénotypage comportemental de souris mutantes, le test de la transition jour / nuit est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement des souris. Le test est basé sur l'aversion naturelle des souris à l'éclat zones éclairées et sur leur comportement exploratoire spontanée dans de nouveaux environnements. Le test est sensible à un traitement anxiolytique. L'appareil se compose d'une chambre noire et d'une chambre brillamment illuminé. Les souris sont autorisés à circuler librement entre les deux chambres. Le nombre d'entrées dans la chambre lumineuse et la durée du temps passé il ya des indices de brillantes espace d'anxiété chez la souris. Pour obtenir des résultats de phénotypage d'une souche de souris mutantes qui peuvent être facilement reproduits et comparés avec ceux des autres mutants, les méthodes d'essai de comportement doivent être aussi identiques que possible entre les laboratoires. Les différences de procédure qui existent entre les laboratoires, toutefois, il est difficile de reproduire ou de comparer les résultats entre les laboratoires. Ici, nous présentons notre protocole pour le test de la transition jour / nuit comme un film de sorte que les détails du protocole peut être démontrée. Dans notre laboratoire, nous avons évalué plus de 60 souches de souris mutantes en utilisant le protocole indiqué dans le film. Ces données seront communiquées dans le cadre d'une base de données publique que nous sommes en train de construire.

Visualisation du protocole facilitera la compréhension des détails de l'ensemble de la procédure expérimentale, permettant de standardisation des protocoles utilisés dans les laboratoires et la comparaison des phénotypes comportementaux des différentes souches de souris mutantes évaluée à l'aide de ce test.

Protocol

  1. L'appareil utilisé pour le test de la transition jour / nuit se composait d'une cage (21x42x25 cm) divisé en deux sections de taille égale par une cloison avec porte (Ohara & Co., Tokyo).
  2. Les souris sont logées trois à quatre par cage dans une pièce avec un 12 h cycle lumière / obscurité (lumières à 07h00) avec un accès ad libitum à la nourriture et l'eau. Idéalement, deux contrôles et deux mutants sont logés ensemble, en réorganisant les souris dès qu'ils sont génotypés au moment du sevrage. Tests comportementaux est réalisée 09h00-18h00 Tous les cages contenant les souris sont transférés à la salle de test de comportement 30 min avant le premier procès commence.
  3. Une chambre est brillamment éclairé par diodes blanches (390 lux), tandis que l'autre chambre est sombre (2 lux). Les souris sont placées dans le côté sombre et la porte est ouverte automatiquement 3 secondes après que la souris est détecté par la caméra infrarouge. La porte est utilisée afin que les souris ne pénètrent dans la chambre de lumière immédiatement après la libération de leur motivation à sortir de l'expérimentateur, depuis le temps de latence pour entrer dans la chambre de lumière peut servir d'indice d'anxiété comportement semblable.
  4. Les souris sont autorisés à circuler librement entre les deux chambres avec la porte ouverte pendant 10 min. L'application utilisée pour l'acquisition et l'analyse des données comportementales (Image LD4) est basé sur le programme J domaine de l'image publique (développé byWayne Rasband à l'Institut national de santé mentale et disponible à http://rsb.info.nih.gov/ij /), qui a été modifié par Tsuyoshi Miyakawa (disponible par O'Hara & Co., Tokyo, Japon).
  5. La distance parcourue dans chaque chambre, le nombre total de transitions, le temps passé dans la chambre de chacun, et le temps de latence pour entrer dans la lumière chamberare enregistrées par image LD4 programme.
  6. Après chaque essai, toutes les chambres sont nettoyées avec de l'eau hypochloreux super pour éviter un biais basée sur les signaux olfactifs.

Discussion

Bien que toutes les séquences du génome de la souris ont été déterminés, les fonctions de la plupart de ces gènes ne sont pas connus. Gene-techniques de ciblage, cependant, peut être utilisé pour supprimer ou manipuler un gène spécifique chez la souris (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004).. L'influence d'un gène donné sur un comportement spécifique peut alors être déterminée par des analyses comportementales des souris mutantes (Takao et Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Comme un test de phénotypage comportemental de souris mutantes, le test de la transition jour / nuit est l'un des tests les plus largement utilisés pour mesurer l'anxiété comme le comportement des souris (Crawley, 2000). Le test est basé sur l'aversion naturelle des souris à l'éclat zones éclairées et sur leur comportement exploratoire spontanée dans de nouveaux environnements (Crawley, 1985). Le test est sensible à un traitement anxiolytique (Crawley, 1985). L'appareil se compose d'une chambre noire et d'une chambre brillamment illuminé. Une ouverture restreinte, 3 cm de haut par 5 cm de large, relie les deux chambres. Les souris sont autorisés à circuler librement entre les deux chambres. Le nombre d'entrées dans la chambre lumineuse et la durée du temps passé là-bas sont utilisés comme des indices de brillantes espace d'anxiété chez la souris.

Le test de transition clair / sombre a été initialement développé par Crawley et ses collègues (Crawley et Goodwin, 1980). Il ya deux différences entre leur version originale et de notre test. Tout d'abord, la chambre de la lumière est plus grande que la chambre noire dans la version originale, tandis que la taille des deux chambres est le même dans notre version d'essai. Deuxièmement, dans la version originale, la chambre n'avait pas de lumière au plafond et les murs de la chambre de la lumière ont été transparentes (Crawley et Goodwin, 1980), tandis que nous utilisons en plastique opaque blanc pour le plafond et les murs de la chambre de lumière. Ces différences, à savoir la taille et l'ouverture de la chambre de la lumière, permettant la détection simultanée de l'espace lumineux-anxiété ainsi que l'espace ouvert d'anxiété dans la version originale du test. Dans notre laboratoire, cependant, l'espace ouvert comme le comportement d'anxiété chez la souris est testé dans un labyrinthe surélevé. Les parois opaques et le plafond, la taille de la chambre de la lumière, et notre lumière spécifique / sombre protocole d'essai de transition est plus spécialisé pour la détection de l'espace-vives inquiétudes par rapport à la version originale.

Bien que le test de transition lumière / obscurité et surélevé labyrinthe sont tous deux utilisés pour évaluer l'anxiété comme le comportement, les résultats ne sont pas toujours cohérentes. Par exemple, prosencéphale spécifiques des souris knockout calcineurine passer une diminution de la quantité de temps dans la chambre de la lumière dans le test de la transition jour / nuit, mais une quantité accrue de temps dans les bras ouverts dans le labyrinthe surélevé (Miyakawa et al., 2003) . Nous avons supposé que notre lumière / test de transition sombre et tests de labyrinthe surélevé d'évaluer les différents aspects de l'anxiété comme le comportement, tels que l'espace lumineux-anxiété et l'angoisse open-space-like comportement. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé un grand ensemble de données recueillies à l'aide de la souris même dans les deux essais. Dans notre laboratoire, nous effectuons des batteries de tests comportementaux qui couvre de nombreux domaines à l'écran pour la signification du comportement des gènes. La batterie de tests nécessite plusieurs semaines à compléter. Pendant la période d'essai, cages à souris sont conservés sur un support dans nos installations. Si les souris sont transportés à notre laboratoire à partir d'autres institutions, ils sont habitués à l'environnement de notre établissement pendant au moins 1 semaine. Après la période d'accoutumance, les souris sont soumises à un contrôle de santé général et le dépistage neurologique (Miyakawa et al., 2003), et après ces examens simples, les souris sont soumises à l'épreuve de transition jour / nuit. L'essai est effectué dans une chambre insonorisée expérimentale après 30 minutes d'accoutumance à la salle d'expérimentation, comme montré dans le film.

Nous avons évalué plus de 60 souches de souris mutantes transgéniques en utilisant le protocole indiqué dans le film et ont un grand ensemble de données brutes de plus de 3000 souris (y compris de type sauvage et des souris mutantes). Nous avons effectué des analyses des facteurs de profiter de l'ensemble important de données brutes. En effet, nous avons détecté des facteurs différents de chaque essai (données non publiées), bien qu'il y avait quelques corrélations significatives entre les indices (données non publiées) .. Ces données seront communiquées dans le cadre d'une base de données publique que nous sommes en train de construire.

Dans notre batterie de tests, sœurs de type sauvage sont généralement utilisées comme contrôle. Comme une souche de fond, des souris C57BL/6J sont couramment utilisés. Nous avons recueilli les données de la souris C57BL/6J utilisé comme un contrôle de souris mutantes dans la batterie de tests. Les indices obtenus à partir de souris C57BL/6J dans notre test de la transition jour / nuit sont les suivantes (n = 795, moyenne SEM), distance parcourue: 846.5 8.88 cm dans la chambre de la lumière, 1478,5 9,53 cm dans la chambre noire, la durée du temps passé : 215,8 1,85 s à la lumière, 395,8 1,86 s dans l'obscurité; nombre de transitions entre les différents compartiments: 30,52 0,43; de latence pour entrer dans la chambre de la lumière: 64,94 2,40 s. Mouvement de la souris autour de l'entrée aux chambres est détecté par la caméra et il est compté comme du temps passé dans les deux cHambers. Pour cette raison, la somme de la durée moyenne du temps passé à la lumière et que dans les compartiments de foncé a été supérieure à celle de toute la durée de l'épreuve (600 s).

Dans notre protocole, une souris est d'abord placé dans la chambre sombre. Trois secondes après avoir placé la souris dans la chambre noire, la porte entre les chambres s'ouvre automatiquement et la souris peut se déplacer librement entre les deux chambres. Souris C57BL/6J passer moins de temps dans la chambre de la lumière que dans la chambre noire (p <0,0001, la durée, si le temps passé à la lumière: 215,8 1,85 s, la durée du temps passé dans l'obscurité: 316.3 2.11 s [le temps passé dans l'obscurité ne comprennent pas le temps initial passé dans l'obscurité avant d'entrer dans la chambre de la lumière pour la première fois], n = 795, jumelé t-test). Cela indique que des souris C57BL/6J ont tendance à éviter la chambre de lumière, et que le temps passé à la lumière est un bon indice de l'anxiété comme le comportement.

Les résultats obtenus à partir de différentes souches de souris mutantes sont facilement comparables, car toutes les données sont obtenues en utilisant le même protocole. Pour obtenir des résultats de phénotypage d'une souche de souris mutantes qui peuvent être facilement reproduits et comparés avec les données des autres mutants, les méthodes d'essai de comportement doivent être aussi identiques que possible entre les laboratoires. Crabbe et ses collègues ont testé l'interaction entre le comportement de la souris et l'environnement de laboratoire en utilisant exactement les mêmes souches consanguines et une souche mutant nul. Dans leur étude, les appareils, les protocoles de test, et de nombreuses variables environnementales ont été rigoureusement standardisées. En dépit de la normalisation, ils ont trouvé des différences systématiques dans le comportement des différents laboratoires, mais ils ont aussi décelé des différences de contrainte dans tous les comportements (Crabbe et coll., 1999). Ils ont rapporté que les variables incontrôlables et des expériences qui caractérisent les mutants peuvent donner des résultats qui sont idiosyncrasiques à un laboratoire particulier. Les différences de procédure qui existent entre les laboratoires, il est difficile de reproduire ou de comparer les résultats entre les laboratoires. Ici, nous présentons notre protocole pour le test de la transition jour / nuit comme un film de sorte que les détails du protocole peut être démontrée.

Etablir la documentation visuelle du protocole facilitera une meilleure compréhension des détails des procédures expérimentales, permettant la normalisation des protocoles utilisés dans les laboratoires et pour la comparaison des phénotypes comportementaux des différentes souches de souris mutantes évaluée à l'aide de ce test. Films d'autres protocoles, comme pour le labyrinthe surélevé, essai sur le terrain ouvert, test de Porsolt nage forcée, conditionnement de la peur, que nous utilisons dans notre batterie de tests comportementaux sont actuellement en cours pour la publication en tant que futurs articles de revue vidéo.

Disclosures

Toutes les procédures ont été approuvées par l'utilisation des animaux et du Comité des soins Université de Kyoto. Tsuyoshi Miyakawa est associée à BIRD, le Japon science et la technologie de l'Agence, Saitama, au Japon.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par des subventions en aide pour les jeunes scientifiques (A) (# 16680015), Grant-in-Aid pour la recherche exploratoire (# 16653065), Grant-in-Aid pour la recherche scientifique sur les zones prioritaires (# 18023022, # 18016012 et # 18053015) du ministère de l'Éducation, Culture, Sports, Science et Technologie au Japon, Grant-in-Aid de promotion des études fondamentales en sciences de la santé de l'Institut national de l'innovation biomédicale (NIBIO), Grant-in- L'aide de neuroinformatique Japan Center (NIJC), RIKEN

References

  1. Austin, C. P. The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
  2. Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
  3. Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
  4. Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
  5. Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. John Wiley & Sons. (2000).
  6. Crawley, J. N. Exploratory behavior models of anxiety in mice. Neurosci Biobehav Rev. 9, 37-44 (1985).
  7. Crawley, J., Goodwin, F. K. Preliminary report of a simple animal behavior model for the anxiolytic effects of benzodiazepines. Pharmacol Biochem Behav. 13, 167-1670 (1980).
  8. Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
  9. Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Science. 284, 1670-162 (1999).

Comments

3 Comments

  1. is it possible to test the same situation(bright light and dark) not simultaneously but on two different times (two different days). For eg one day test for dark exploration in an open field and the following day after ²4 hours test for bright light.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2009 - 9:39 PM
  2. It is very informative for doing animal research. Do you have Attentional Set-shifting Test video? An experimental test for cognitive function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 8, 2011 - 10:22 AM
  3. Now, ImageLD software is freely available at the following site.
    http://www.mouse-phenotype.org/software.html

    Reply
    Posted by: Tsuyoshi M.
    April 25, 2013 - 8:51 PM

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