Een magnetisch Tether System om visuele en olfactorische Mediated Flight Control in Drosophila Onderzoek

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschrijven we hoe je ketting een vlieg in een geur magnetische-tether (OMT) toestellen. We beschrijven hoe de zeldzame-aarde magneten en geur-poorten, en hoe om de massastroom vastgestelde tarieven voor zowel de stimulus levering en afzuiging om een ​​optimale geur tracking te bereiken af ​​te stemmen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Duistermars, B. J., Frye, M. A. A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila. J. Vis. Exp. (21), e1063, doi:10.3791/1063 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het is al duidelijk voor de vele jaren dat insecten visuele aanwijzingen gebruiken om hun kop in de wind stroom te stabiliseren. Veel dieren spoor geuren uitgevoerd in de wind. Als zodanig, visuele stabilisatie van de wind tracking direct helpt bij het volgen van geur. Maar maak je olfactorische signalen direct invloed op visuele tracking gedrag onafhankelijk van wind signalen? Ook is de recente stortvloed aan onderzoek naar de neurofysiologie en neuro genetica van reukzin in Drosophila gemotiveerde steeds meer technisch geavanceerde en kwantitatieve gedrag assays. Hier hebben we aangepast een magnetisch koord systeem oorspronkelijk ontworpen voor het gezichtsvermogen experimenten door de inrichting van de arena met een smalle laminaire stroming geur pluimen. Een vlieg is gelijmd op een klein stalen pin en opgehangen in een magnetisch veld dat in staat stelt om vrij te gieren. Kleine diameter voedsel geur pluimen zijn naar beneden gericht boven het hoofd van de vlieg s, opwekken stabiel volgen door een hongerige vliegen. Hier richten we ons op de kritische mechanica van tethering, het uitlijnen van de magneten, het ontwerpen van de geur pluim, en bevestiging van stabiele geur tracking.

Protocol

Introductie

Het OMT is een aanpassing van een magnetisch ketting systeem [1] ontworpen om een ​​"virtuele pluim simulator" te nemen. De volgende protocollen wordt uitgelegd hoe je de juiste ketting vliegt (deel 1) en biedt strategieën voor het opzetten van de magneten (deel 2) en massa-flow gereguleerd geur afgiftesysteem (Deel 3). De informatie die hier beschreven is geoptimaliseerd voor dit bijzondere systeem en kan variëren voor componenten met andere technische specificaties.

Deel 1: Tethering vliegt

De stappen voor het aanbinden hier beschreven zijn vergelijkbaar met een groot aantal eerdere studies [2], maar aangepast voor gebruik in een OMT [3]. Juiste tethering is van cruciaal belang om robuuste en reproduceerbare experimentele proeven te garanderen. Het belang van een zorgvuldige tethering kan niet worden overschat.

  1. Verzamel vliegt 4-6 dagen na de Eclosion en verhongeren ze voor 4-6 uur. Plaats een kimwipe bevochtigd met water in de foodless flacon om uitdroging te voorkomen.
  2. Overdracht van een partij van vliegen uit een fles naar een klein flesje en plaats deze in een koperen blok op een Peltier koeling podium op ongeveer 4 graden Celsius. De juiste temperatuur anesthetizes de vliegen binnen ongeveer 30 seconden.
  3. Sorteer de vliegen op de koude oppervlak van de koeling podium. Een vochtige Kimwipe zorgt voor een constante koeling en vochtafvoerende van de cuticula. Kies de grootste wijfjes voor het aanbinden.
  4. Met behulp van een fijn penseel, druk op een enkele vlieg in positie in de custom-built sarcofaag gevormd om een ​​wild-type vrouwelijke fruitvlieg tegemoet te komen.

    Figuur 1.
    Klik hier om een grotere versie van de de figuur te zien.
  5. We positie een minutien pin (Fines Science Tools) met een magnetische staaf gemonteerd op een micromanipulator. De pen dient te worden gericht dat de stompe einde van de dorsale thorax raakt net achter het hoofd tussen de twee vleugels. De pen moet worden perfect verticaal wanneer bekeken head-on in de richting van de ogen. Zelfs een kleine hoeveelheid van de 'roll' tussen de vliegen en pin kan niet worden getolereerd. Het zijaanzicht hoek tussen de pin en de lange as van het lichaam moet op een neus-up hoek van 30 graden ten opzichte van de horizon (fig. 1). Opmerking: Voor een optimale werking in de magneet tether, de pinnen moet mogelijk worden afgesneden tot kortere lengtes. Dit zal volledig afhangen van de afstand tussen de schorsing magneten.
  6. Zodra de minutien uitgelijnd is, gebruik dan een dunne stalen draad naar een klein druppeltje van UV-geactiveerde lijm (elektroliet Corp) om het stompe eind van de minutien pin toe te passen.
  7. Manipuleren van de pin, zodat de lijm druppel raakt de vlieg thorax net boven het hoofd. Met de juiste druppelgrootte, moet de lijm gloeien en de stroom van de pin op de thorax. Wees voorzichtig niet te veel lijm gebruikt.
  8. Cure de lijm met twee 20 seconden salvo's van UV-licht.
  9. Opzij plaats de vaste vliegen en te herhalen. Snijd kleine vierkanten van Kimwipe en met een tang een aan elk vastgebonden vliegen op de vlucht te beteugelen.
  10. Na een uur van het herstel, de tethered vliegen klaar zijn voor experimenten.
  11. Onjuiste lijmen kunnen belemmeren een vlieg in staat is om uit te voeren in de magneet arena. Elke vlieg moet worden gecontroleerd voor een soepele rotatie bij de start van elk experiment om ervoor te zorgen dat de vliegen goed gelijmd. Dit kan worden bereikt door het draaien van een gestreept patroon met een voldoende grote ruimtelijke periode van sterke optomotor reacties uitlokken [4]. Als de vlieg is gelijmd op de verkeerde toonhoogte hoek of gekanteld op de pin met betrekking tot de rol-as, de vlieg kan (i) niet draaien op alle, (ii) hebben een beperkt bereik van de beweging, of (iii) draaien op inconsistente snelheid. In deze gevallen mag de vlieg moet worden weggegooid en vervangen door een nieuwe. Als dit het probleem oplost was het waarschijnlijk een geval van oneigenlijk lijmen. (Als vervanging van de vlieg niet het probleem, zie deel 2.4)

Deel 2: Het uitlijnen van de magneten

Het uitlijnen van de magneten (Rare-earth-magnets.com) correct is noodzakelijk voor het vliegen naar een soepele 360 ​​graden bereik van de beweging te bereiken. Volg deze stappen om goed uitlijnen van de magneten.

  1. De onderste ring magneten horizontaal gehouden door een plastic hoes en die direct op de top van een duidelijke vacuümkamer (Fig. 1; verder beschreven in deel 3). De bovenste staafmagneet is verticaal ongeveer 3 / 4 "vaste boven de onderste magneten.
  2. Ruwweg visueel uitlijnen van de bovenste en onderste magneten door het plaatsen van de bovenste staafmagneet direct boven het midden van de onderste ring magneten. Het is nuttig om de bovenste magneet hechten aan een micromanipulator (Siskiyou Inc) voor fijn afstelling schaal.
  3. Epoxy een V-juweel lager (kleine onderdelen) aan de onderkant van de bovenste magneet rotatie wrijving te minimaliseren en te standaardiseren vliegen positionering.
  4. Plaats een vlieg in de arena en de horizontale en vertical positie van de bovenste magneet tot de fly kan soepel en geleidelijk 360 graden draaien in de yaw-as. Elke vlieg moet worden gecontroleerd voor een soepele rotatie bij de start van elk experiment om ervoor te zorgen de magneten goed zijn uitgelijnd en dat individuele minutien pinnen niet beschadigd zijn (zie deel 1.11). Als de magneten zijn niet goed uitgelijnd-the-fly kan (i) niet draaien op alle (ii) hebben een beperkte range of motion (iii) draaien op inconsistent snelheden. Als het probleem is opgelost door het vervangen van de vliegen met een nieuwe, het was waarschijnlijk te wijten aan een lijmen probleem (zie deel 1). Als deze problemen bestaan ​​voor elke vlieg, is het waarschijnlijk een probleem met de uitlijning van de magneten en de verdere aanpassing nodig zullen zijn.
  5. Waarschuwing: tijdens het spelen met zeldzame aarde magneten kan leuk zijn, ze zijn erg gevaarlijk. Misbruik resulteert in beschadigde apparatuur en / of kleine lichamelijk letsel. Wees uiterst voorzichtig met deze verleidelijke maar eenvoudig onderschat magneten.

Deel 3: Geur Levering

  1. De geur levering systeem is gebaseerd op een eerder beschreven [5] en is het zwaarste deel te optimaliseren (fig. 1). Het vergt veel geduld en trial-and-error. Volg deze stappen om een ​​stabiele geur tracking te bereiken.
  2. De initiële set-up van de geur systeem vereist draait smalspoor Teflon tubing (Small Parts) van de gas-multiplexer (Sable Systems International) om de op maat gemaakte water / geur flacons. De uitlaat van deze flacons wordt direct aangesloten op de onderhuidse port-buizen met behulp van dezelfde Teflon slang.
  3. Een duidelijke acryl vacuümkamer is gepositioneerd onder de arena om de magneten te ondersteunen. We maken gebruik van een 4 mm glazen buis gemonteerd onder de vlieg is aangesloten op de vacuümkamer om het vacuüm opening dichter bij de vlieg te brengen en de diameter van de opening te verminderen.
  4. Plaats een vastgebonden vliegen in de arena met behulp van pincet.
  5. Zet een aantrekkelijke geur (appel cider azijn werkt goed), en visueel te controleren of de vlieg de geur tracks. Als de vlieg lijkt te hebben geen voorkeur voor de geur, volg dan de volgende drie stappen. Dit kan betekenen dat een aantal vliegen, en een aantal onderzoeken.
  6. Pas de positie van de geur-poort tot de vlieg lijkt te volgen van de geur. We hebben de geur-poorten op micromanipulators (Siskiyou Inc) en gepositioneerd 4mm rugvin en de 3mm anterior gemonteerd aan het hoofd van de vlieg.
  7. Stel het massadebiet totdat de vlieg lijkt te volgen van de geur. Onze instellingen zijn 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).
  8. Stel het debiet van het vacuüm tot de vlieg lijkt te volgen van de geur. We stellen het vacuüm debiet 13l/min bij het gebruik van een debietregelaar (Cole Parmer). Let op: Bouwen vacuüm aanvoerlijnen zijn niet constant in de tijd waardoor fluctuaties in de pluim structuur. Het kan nuttig zijn om een ​​externe vacuum pomp aan te sluiten om de stroom regelaar voor constante vacuüm stromingscondities.
  9. Zodra de positie van de haven en de debieten worden ingesteld, regelmatig wisselen tussen het leveren van waterdamp en geur damp met behulp van een schakelbare met behulp van een gas-multiplexer en visueel te controleren of de vlieg alleen de geur tracks als de geur op. Af en toe kan resterende geur in de geur-poort te lokken geur volgen wanneer de geur is uitgeschakeld. Dit kan worden voorkomen zonder de juiste positie geur-poort door het vullen van de injectiespuit buizen met ethanol en het verzamelen van het op de levering eindigen met een Kimwipe. Met behulp van perslucht, blaas resterende ethanol uit en hervat experimenten.

Representatieve resultaten:

Wanneer deze stappen correct zijn gevolgd twee dingen zouden moeten worden genomen. De eerste, onder constante draaien visuele stimuli een vastgebonden vlieg geplaatst in de OMT moeten soepel draaien 360 graden in de yaw-as. "Jerky" draait (de zogenaamde saccades) zijn kenmerkend voor spontaan gedrag te draaien in de afwezigheid van een constante visuele stimuli. Als vliegen kunnen blijkbaar niet soepel draaien, kan onjuiste lijmen (zie deel 1) en niet goed uitgelijnd magneten zijn te wijten (zie deel 2). Ten tweede, wanneer de geur wordt ingeschakeld, moet de vlieg hoofd in de richting van de geur. Als de geur is uitgeschakeld, moet de vliegen spontaan saccade met geen voorkeur voor een enkele positie in de arena. Als vliegen niet actief bijhouden van de geur pluim, de positie van de geur haven, de lucht-debiet en / of het vacuüm debiet kan het nodig zijn aangepast (zie deel 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tethering vliegen en uitlokken stabiel geur volgen in deze arena is relatief eenvoudig. Het vergt oefening, geduld en trial and error. Veel onderdelen van deze arena kan verder worden geoptimaliseerd of vervangen om variaties in de experimentele potentiële opbrengst. Bijvoorbeeld, nieuwere versies van de vacuümkamer zijn veel kleiner en laten meer ruimte onder de arena. Ook kan de kracht en het type van zeldzame aarde magneten enigszins worden gevarieerd en extra geur-poorten kunnen worden toegevoegd aan het aantal geur soorten en / of concentraties gebruikt in experimenten te verhogen. Wij merken op dat eventuele afwijkingen in de apparatuur op maat optimalisatie nodig is. Zoals hier beschreven, de Omta stelt gebruikers in staat om te testen het effect van visuele cues op de geur lokalisatie. Een grote verscheidenheid aan visuele stimuli kan worden aangeboden met de LED-paneel systeem en in combinatie met de veelzijdigheid en uitbreidbaarheid van de geur levering systeem biedt het systeem de mogelijkheid om visueel-reuk-integratie te verkennen op vele niveaus. Dit systeem draagt ​​ook bij aan het toenemend aantal kwantitatieve gedrags-assays voor Drosophila, in het bijzonder voor het karakteriseren van het gedrag van het vliegen volwassenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Financiering door de National Science Foundation (MF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cooling Stage Teca LHP-300CP
Brass Cooling Block Custom Made ~4 x 8 x 2cm
Sarcophagus Custom Made Contact us for details
UV-Activated Glue Kemxert corp KOA300 1oz bottle lasts years
Panel System Caltech http://www.dickinson.caltech.edu/panels [4]
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-20
Lower Ring Magnets Rare-earth-magnets.com NSN0615 5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"
Upper Rod Magnet Rare-earth-magnets.com NSN0750 0.125" x 1"
V-Jewel Bearing Small Parts, Inc. VJ-0469-01
MFC-4 Flow Regulators Sable Systems International
Gas Multiplexer Sable Systems International
Teflon Tubing Small Parts, Inc. STT-20-C
20 Gauge Hypodermic Tubes Small Parts, Inc. HTX-20R-06
Glass Tubing 4mm o.d.
Vacuum Flow Regulator Cole-Parmer EW-32464-52

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bender, J. A., Dickinson, M. Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila. J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).
  2. Tammero, L. F., Dickinson, M. H. Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).
  3. Duistermars, B. J., Frye, M. A. Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight. Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).
  4. Reiser, M. B., Dickinson, M. A modular display system for insect behavioral neuroscience. J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).
  5. Frye, M. A., Dickinson, M. H. Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila. J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics