Drosophila larval NMJ Disección

Biology

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Summary

Este protocolo muestra cómo diseccionar

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Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).

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Abstract

La

Protocol

Antes de empezar

  1. Todas las culturas deben ser cultivadas a 25 ° C.
  2. HL3.1 buffer disección puede ser preparado de antemano. Tomar una alícuota de 50 ml de HL3.1 y mantener en hielo.
  3. Prepare 15 ml de formaldehído fresco 3,5% en HL3.1. Mantenga en hielo.

Disección de larvas

  1. Ponga una gota de frío HL3.1 en la placa de disección. Esto evitará que el animal se seque y aturdir al animal por lo que es más fácil trabajar con.
  2. Usando las pinzas largas, seleccione una larva de tercer estadio errantes y colocarlo en la caída de HL3.1.
  3. En primer lugar, el uso de fórceps corto para captar un alfiler minutien. Coloque el pasador entre los espiráculos posteriores. Los animales por lo general tratan de arrastrarme de la clavija se extiende hacia fuera y lo que es más fácil para que usted ponga un alfiler de lleno en la cabeza de la larva cerca de los ganchos de la boca. Tramo al animal a lo largo. Esto le ayudará a maximizar la cantidad de la pared expuesta del cuerpo se puede lograr durante el corte. Nota: Si usted decide echar la cabeza, el animal puede envolver su cuerpo alrededor de la clavija o el látigo de su cuerpo hacia atrás y adelante por lo que es difícil de precisar. Por lo general, se puede contrarrestar esta quitando el HL3.1 y colocar una gota fría impresionante fresco del animal una vez más. El científico ambidiestro también acaba de agarrar al animal y mantenerlo en su lugar.
  4. Con la tijera de primavera hacer una incisión horizontal justo anterior a la posterior pin en la parte dorsal de la larva. Coloque una hoja de la tijera en la incisión y realizar un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal hacia el extremo rostral de la larva. En la tribuna de los animales hacen incisiones horizontales a la izquierda ya la derecha del pasador. Nota: el resultado final debe ser similar a uno que en la parte dorsal de la larva en el eje rostrocaudal.
  5. Extraer los órganos. Comience por poner varias gotas adicionales de HL3.1 en la larva. Esto permitirá a los órganos de flotar fuera del cuerpo, lo que le permite eliminar con mayor facilidad. En primer lugar, eliminar el sistema traqueal. En segundo lugar, utilizar las pinzas para agarrar el resto de los órganos y eliminarlos.
  6. Durante el paso 3 se hizo una aleta izquierda y la aleta derecha en la pared del cuerpo. Pin los flaps en un fin de asegurarse de que las agujas del reloj para estirar la pared del cuerpo, tanto horizontales como verticales.

Fijación

Fijar cada animal en el 3,5% de formaldehído en HL3.1 durante 25 minutos. Lave al animal dos veces en HL3.1 durante 5 minutos.

Almacenamiento

Retire los pernos y la transferencia de las larvas a un tubo de 1.5 ml contiene 1X PBS. Si va a utilizar la imagen de la UNM fundido etiquetas fluorescentes, se debe la imagen de los animales en dos días. Puede almacenar las larvas disecadas de hasta una semana a 4 ° C.

Los resultados representativos

Hay varios componentes clave para una adecuada disección larvas de Drosophila. En primer lugar, hay que tener cuidado de no dañar los músculos, especialmente los músculos de 4, 6 y 7. Estos son los músculos más popular para el estudio y si se dañan descartar la preparación de filetes y diseccionar a otro animal. En segundo lugar, hay que asegurarse de que el animal está al máximo se extendía de manera que cada músculo y la UNM se pueden distinguir.

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Discussion

La técnica de disección se demuestra en este vídeo se puede utilizar para preparar a las larvas de Drosophila para una variedad de técnicas experimentales. Si las etiquetas fluorescentes de proteínas están presentes, las larvas pueden ser montados y la imagen de inmediato. De lo contrario, la inmunotinción se puede realizar con el fin de marca específica compartimentos sináptica. Además, la electrofisiología se puede realizar fácilmente en las larvas disecados para evaluar el funcionamiento de la neurotransmisión.

La NMJ de Drosophila ha ganado gran popularidad desde los primeros estudios que iluminó su estructura y las funciones básicas. 1.4 Muchas de las moléculas que han sido identificados en estudios del desarrollo de la Drosophila NMJ se conservan en los vertebrados. 4 Por lo tanto, muchos de los las ideas aprendidas a través de estudios de la Drosophila NMJ son aplicables a la biología sináptica en todos los seres vivos. Algunas aplicaciones posibles incluyen el estudio de moléculas implicadas en el direccionamiento del axón, la enfermedad de la neurona motora, el aprendizaje y la memoria.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000 Carl Zeiss, Inc. 495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD Carl Zeiss, Inc. 000000-1063-181
3mm Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-0
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33 Long forceps
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Short forceps
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 Used to make dissection plates
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549-25ML
Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter Fine Science Tools 26002-10
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.


Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

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References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73-1137 (1993).
  5. Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, (2), 377-402 (2004).

Comments

2 Comments

  1. Hi. I wonder if the fixation using formaldehyde is fine for any ulterior immunohistochemistry assay. Have you any experience if there is necessities for performing the fixation with other fixative? I´m asking this regarding the preservation of cytoskeletal proteins

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 4:07 PM
  2. Very well done Mr. Brent. You have a have steady hand !    

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 17, 2009 - 10:47 AM

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