Drosophila Larven NMJ Dissection

Biology

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Summary

Dieses Protokoll zeigt, wie Sie sezieren

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Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107, doi:10.3791/1107 (2009).

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Abstract

Die

Protocol

Bevor Sie beginnen

  1. Alle Kulturen sollten bei 25 ° C gezüchtet werden
  2. HL3.1 Dissektion Puffer kann im Voraus zubereitet werden. Nehmen Sie einen 50 ml Aliquot HL3.1 und bewahren Sie es auf Eis.
  3. Bereiten Sie 15 ml frischer 3,5% Formaldehyd in HL3.1. Halten Sie es auf Eis.

Larven Dissection

  1. Gib einen Tropfen des kalten HL3.1 auf der Dissektion Platte. Dies wird das Tier vor dem Austrocknen und betäuben das Tier macht es einfacher, mit der Arbeit zu halten.
  2. Mit dem langen Pinzette, wählen Sie eine Wanderung dritten Larvenstadium Larve und legen Sie sie in den Tropfen HL3.1.
  3. Verwenden Sie zunächst kurz Pinzette zu einem minutien pin zu erfassen. Legen Sie den Stift zwischen den hinteren Luftlöcher. Das Tier wird in der Regel versuchen, kriechen vom Stift erstreckt sich aus und macht es einfacher für Sie, einen Stift direkt in den Kopf der Larve der Nähe der Mündung Haken. Stretch das Tier in die Länge. Dies wird Ihnen helfen zu maximieren die Menge des exponierten Körpers Wand Sie beim Schneiden erreichen können. Hinweis: Wenn Sie auf den Kopf ersten Stift zu wählen, kann das Tier seinen Körper um den Stift wickeln oder Peitsche seinen Körper hin und her macht es schwierig, pin. Sie können in der Regel dem entgegenzuwirken, indem die HL3.1 und setzen ein frisches, kaltes Tropfen betäubt das Tier wieder. Die Rechts-und Linkshänder Wissenschaftler können auch einfach packen das Tier und halten es fest.
  4. Mit Feder Schere einen horizontalen Schnitt knapp vor den hinteren Pin auf der Rückenseite der Larve. Legen Sie ein Blatt der Schere in den Schnitt und einen vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie in Richtung des rostralen Ende der Larve. Auf der Tribüne des Tieres machen horizontale Schnitte, die links und rechts des Stiftes. Hinweis: das fertige Ergebnis sollte wie ein I auf der Rückenseite der Larve entlang der rostrokaudalen Achse betrachten.
  5. Entfernen Sie den Organen. Beginnen Sie, indem Sie einige zusätzliche Tropfen HL3.1 auf die Larve. Dies ermöglicht es den Organen zu schweben aus dem Körper so dass Sie diese viel leichter zu entfernen. Entfernen Sie zuerst den Tracheen. Zweitens nutzen die Zange, um den Rest der Organe zu packen und zu entfernen.
  6. In Schritt 3 Sie machte eine linke Klappe und rechte Klappe in die Wand des Körpers. Pin die Klappen im Uhrzeigersinn achten Sie darauf, die Wand des Körpers sowohl horizontal als auch vertikal zu strecken.

Fixierung

Fix jedes Tier in 3,5% Formaldehyd in HL3.1 für 25 Minuten. Waschen Sie die Tiere zweimal in HL3.1 für 5 Minuten.

Lagerung

Entfernen Sie die Stifte und übertragen die Larven in ein 1,5 ml Röhrchen mit 1X PBS. Wenn Sie zum Bild der NMJ mit verschmolzen fluoreszierenden Markierungen planen, sollten Sie Bild der Tiere innerhalb von zwei Tagen. Sie sind berechtigt, die seziert Larven bis zu einer Woche bei 4 ° C.

Repräsentative Ergebnisse

Es gibt mehrere wichtige Komponenten, um ein richtig seziert Drosophila Larve. Zuerst muss man besonders vorsichtig nicht zu den Muskeln, vor allem Muskeln 4, 6 und 7 führen. Dies sind die beliebtesten Muskeln zu studieren und wenn sie beschädigt sind zu verwerfen das Filet prep und sezieren ein anderes Tier. Zweitens muss man darauf achten, dass das Tier maximal ist so gespannt, dass jeder Muskel und NMJ unterschieden werden können.

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Discussion

Die Dissektionstechnik in diesem Video gezeigt, kann zur Drosophila-Larven für eine Vielzahl von experimentellen Techniken vorzubereiten. Wenn fluoreszierende Protein-Tags vorhanden sind, können die Larven montiert und abgebildet sofort. Ansonsten kann Immunfärbung durchgeführt, um spezifische synaptische Fächer zu markieren. Darüber hinaus können Elektrophysiologie leicht auf der präparierten Larven durchgeführt werden, um das Funktionieren der Neurotransmission zu bewerten.

Die NMJ von Drosophila hat große Popularität seit den frühen Studien, dass die grundlegende Struktur und Funktion beleuchtet gewonnen. 1-4 Viele der Moleküle, die in Studien über die Entwicklung der Drosophila NMJ identifiziert wurden bei Wirbeltieren konserviert sind. 4 Darum, viele von die Erkenntnisse durch Untersuchungen der Drosophila NMJ gelernt gelten für synaptische Biologie in allen Lebewesen. Einige mögliche Anwendungen sind die Untersuchung von Molekülen in Axon Führung beteiligt, Motoneuronerkrankung, Lernen und Gedächtnis.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000 Carl Zeiss, Inc. 495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD Carl Zeiss, Inc. 000000-1063-181
3mm Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-0
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33 Long forceps
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 Short forceps
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097358-1004 Used to make dissection plates
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549-25ML
Stainless Steel Minutien Pins -0.1 MM Diameter Fine Science Tools 26002-10
HL3 Dissection Buffer: (in mM) 70 NaCl, 5 KCl, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 sucrose, and 5 HEPES, pH 7.3.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.


Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.
Sylgard Dissecting Plate: Mix gently (to avoid bubbles) 10:1in a beaker. Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37C incubator.

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References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila. Cell. 73-1137 (1993).
  5. Feng, A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, (2), 377-402 (2004).

Comments

2 Comments

  1. Hi. I wonder if the fixation using formaldehyde is fine for any ulterior immunohistochemistry assay. Have you any experience if there is necessities for performing the fixation with other fixative? I´m asking this regarding the preservation of cytoskeletal proteins

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2009 - 4:07 PM
  2. Very well done Mr. Brent. You have a have steady hand !    

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 17, 2009 - 10:47 AM

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