Drosophila larvali NMJ Immunoistochimica

Biology

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Summary

Questo protocollo illustra come eseguire immunoistochimica su sezionato larva di Drosophila.

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Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108, doi:10.3791/1108 (2009).

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Abstract

Il

Protocol

Prima di iniziare

  1. Preparare le seguenti soluzioni: PBT (0,1% Triton X100 in PBS 1X), PBTB (0,2% BSA in PBT), e PBTN (2% in PBTB NGS).
  2. Sezionare larve di Drosophila. Si prega di consultare Drosophila larvale Dissection NMJ.

Immunoistochimica

  1. Spostare le larve in una provetta contenente 1,5 ml PBT. Lavare le larve due volte per 15 minuti in PBT. Nota: per lavare, posizionare il tubo di 1,5 ml di un mixer nutator. Asportare il liquido con un pippetor e sostituirlo con il liquido fresco.
  2. Rimuovere il PBT. Lavare in PBTB due volte per 30 minuti.
  3. Rimuovere il PBTB. Lavare in PBTN due volte per 15 minuti.
  4. Incubare in anticorpo primario diluito in PBTN a temperatura ambiente per 1 ora o al 4 º C durante la notte.
  5. Sciacquare due volte con PBTB. Nota: alla soluzione di risciacquo aggiungere e rimuovere in fretta.
  6. Lavare due volte per 15 minuti in PBTB.
  7. Lavare in PBTN per 30 minuti.
  8. Incubare in anticorpo secondario (e coniugato anticorpo primario se si utilizza uno) diluito in PBTN.
  9. Copertura in stagnola e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
  10. Sciacquare due volte con PBTB.
  11. Lavare due volte per 15 minuti con PBTB.
  12. Procedere al montaggio.

Montaggio

Nota: il Monte in glicerolo se i campioni saranno immediatamente ripreso. Montare a prolungare oro se i campioni saranno conservati prima immagine (per più di una settimana) o se i campioni devono essere ripreso più volte. Per utilizzare, posto una bottiglia di prolungare a 65 ° C bagnomaria per 2-3 minuti. Prelevare un 'aliquota di prolungare oro e di tenere a fuoco-block a 45-50 º C.

  1. Versare prepara macchiato in PBT per un vetro da orologio.
  2. Metti un po 'glicerolo su un vetrino pulito per l'elaborazione.
  3. Spostare gli animali per far scorrere il trattamento con la scelta fuori dal vetro da orologio da un angolo con pinze. Assicurare che siano parte cuticole verso il basso.
  4. Togliere la testa e la coda con una lama di rasoio fresca sul vetrino di elaborazione. Exacto un coltello con lama # 16 funziona bene per questo.
  5. Su un altro scivolo (montaggio di diapositive), mettere una piccola goccia di glicerolo / prolungare e stenderlo con una pinza pulita.
  6. Spostare gli animali sezionati al vetrino di montaggio al loro margine, facendo attenzione a non invertire loro. Prova a montarli in fila con lo stesso orientamento. Monte 6-8 animali per vetrino.
  7. Caduta di una scivolata sulla copertura mettendo un bordo in glicerolo / Prolungare e lentamente liberando.
  8. Sigillare la diapositiva con smalto. [Nota Non immagine fino a quando la vernice è asciutta. Questo di solito prende dieci minuti. Per i campioni montati in oro prolungare, lasciate le diapositive asciugare per almeno tre ore prima di chiusura o di immagini.]

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Discussion

Immunoistochimica (IHC) è di vitale importanza per lo studio della biologia NMJ perché consente la visualizzazione delle NMJ. Questo è ottenuto utilizzando anticorpi che riconoscono la membrana neuronale (ad esempio, HRP), il presynapse (ad esempio, CSP, SYT), e / o il postsynapse (ad esempio, DLG). Molecole di segnalazione, proteine ​​strutturali, nuove proteine ​​o di interesse possono anche essere colorati. Poi, i geni possono essere mutati o missexpressed e IHC in grado di rilevare perturbazione di struttura sinaptica e / o di segnalazione neuronali.

Il NMJ di Drosophila ha guadagnato grande popolarità da quando i primi studi che illuminava la sua struttura di base e la funzione. 1-4 Molte delle molecole che sono stati identificati in studi di NMJ Drosophila sono conservati nei vertebrati. 4 Perciò, le intuizioni appreso attraverso gli studi del NMJ Drosophila possono essere applicabili alla biologia sinaptica in molti sistemi. Alcune applicazioni possibili includono lo studio di molecole coinvolte nello sviluppo sinaptica, plasticità, e le malattie neurologiche.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000 Carl Zeiss, Inc. 495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD Carl Zeiss, Inc. 000000-1063-181
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Adams™ Nutator Mixer BD Biosciences 421105
No.1 Precision knife X-Acto 3201
No. 16 Blades X-Acto 216
ProLong Gold Antifade reagent Invitrogen 36930

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17, (1), 35-42 (2007).

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