Metodi elettrofisiologici per la registrazione Potenziali Synaptic dal NMJ Larve di Drosophila

Biology

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Summary

Qui si descrivono i metodi elettrofisiologici per la misurazione della trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare larva di Drosophila. Rilascio evocato è iniziata artificialmente stimolando gli assoni dei motoneuroni, e la trasmissione attraverso il NMJ può essere misurata la risposta postsinaptica evocata nel muscolo.

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Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (24), e1109, doi:10.3791/1109 (2009).

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Abstract

In questo video, si descrivono i metodi elettrofisiologici per la registrazione, la trasmissione sinaptica a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) larva di Drosophila. Il sistema larvale neuromuscolare è una sinapsi modello per lo studio della fisiologia e la neurotrasmissione sinaptica, ed è un valido strumento di ricerca che ha definito la genetica ed è accessibile alla manipolazione sperimentale. Larve possono essere sezionato per mostrare il corpo muro muscolatura, sistema nervoso centrale, e dei nervi periferici. I muscoli di Drosophila e il loro modello di innervazione sono ben caratterizzati e muscoli sono di facile accesso per la registrazione intracellulare. Singoli muscoli possono essere identificati dalla loro posizione e l'orientamento all'interno degli 8 segmenti addominali, ciascuno con 30 muscoli disposti in uno schema che si ripete in segmenti A2 - A7. Sezionato larve drosofila sono i muscoli sottili e individuali e fasci di assoni dei neuroni motori possono essere visualizzati con transilluminazione

Protocol

Prima di iniziare la preparazione:

  • Vagando yhird instar Drosophila larve
  • HL3.1 (Modificata emolinfa-like) soluzione
  • Sylgard (gomma siliconica trasparente) dissezione piatti preparati in piccolo (35 x 10 mm) scatole Petri in plastica usando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008) 3.
  • Tagliare perni dissezione breve
  • Stimolare pipette elettrodo
  • Pipette di registrazione Sharp

HL3 Soluzione:

  1. Durante dissezioni ed esperimenti elettrofisiologici, larva sono immersi in HL3.1 soluzione 2 che contiene (in mm): 70 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 trealosio, 115 saccarosio, e 5 HEPES, pH 7,2.
  2. Le concentrazioni di CaCl 2 si aggiungono alla soluzione HL3.1 di fornire la necessaria concentrazione extracellulare di Ca 2 +.
    • Dissezioni larvali vengono eseguiti a basse concentrazioni di Ca 2 + (per evitare la contrazione muscolare) utilizzando HL3.1 + 0,25 mM CaCl 2, tenuta in ghiaccio.
    • Esperimenti elettrofisiologici sono in genere registrati in HL3.1 + 1 mM CaCl 2, ma questa può essere regolata 0,4-1 mM Ca 2 + come richiesto.
  3. La soluzione è HL3.1 filtro sterilizzati prima dell'uso, e conservati a 4 ˚ C.

Preparazione di stimolare e pipette di registrazione:

  1. Pipette di registrazione e stimolanti sono tirati con un P-2000 Sutter estrattore basato Laser micropipetta utilizzando le seguenti impostazioni: calore = 390, Filament = 4, Velocità = 35, Delay = 200 e Pull = 0.
  2. Elettrodi stimolanti sono preparati con pareti sottili capillari in vetro borosilicato con estremità ampia che erano leggermente più grande della larghezza della assoni motori reciso. Le estremità sono a forma di firepolished per dare una finitura liscia (utilizzando una pipetta Narashiga lucidatore), per minimizzare i danni al nervo. Elettrodi stimolanti sono riempite con soluzione bagno (HL3.1 + 1 mM Ca 2 +).
  3. Gli elettrodi di registrazione sono preparati da 1,2 millimetri di vetro borosilicato, che viene prelevata per formare una pipetta acuto (30-60 mΩ), e riempito di KCl 3M.

Parte 1: dissezione di larve di Drosophila

  1. Terzo larve instar erranti sono sezionato per mostrare i muscoli nella parete del corpo come descritto in precedenza 4.
  2. Dissezioni sono eseguite in HL3.1 + 0,25 mM Ca 2 + su lastre di silicone piccolo (35 x 10 mm). HL3.1 soluzione deve essere ghiacciata per dissezioni al fine di anestetizzare la larva, e viene mantenuto in ghiaccio prima e durante la dissezione.
  3. Le larve sono sezionati utilizzando i metodi descritti da Brent e McCabe (2008), che viene modificato per gli esperimenti di elettrofisiologia con l'aggiunta di 0,25 mm Ca 2 + alla soluzione HL3.1 dissezione, e con perni dissezione breve (circa 2 mm di lunghezza) che sono meno probabilità di colpire l'obiettivo microscopio e gli elettrodi durante un esperimento.
  4. A seguito di dissezione, gli assoni motori delle larve sono interrotti. Questo viene fatto delicatamente tenendo il sistema nervoso centrale e alzando leggermente in modo da i nervi periferici che innervano i muscoli posteriori del ganglio ventrale può essere tagliata senza danneggiare i muscoli (Figura 1). Il cervello viene quindi rimosso.
  5. La preparazione larvale sezionato viene lavato due volte con HL3.1 + 1 mM Ca 2 +.

Figura 1
Figura 1. Schematica che mostra i passaggi necessari per il taglio del assoni motori di larve sezionato. La CNS è sollevato con una pinza e gli assoni motori sono tagliati alla base del cervello.

Parte 2: le registrazioni intracellulari da cellule muscolari larvale.

  1. Posizionare la piastra di dissezione sul microscopio elettrofisiologia e sommergere la preparazione con HL3.1 + 1,5 mM Ca 2 + e fissare l'elettrodo in modo da bagno è in contatto con la soluzione.
  2. Tutti gli esperimenti vengono eseguiti su muscoli 6 anni entro il terzo segmento addominale (A3). Nervi periferici che innervano i muscoli sono stimolati utilizzando un elettrodo di aspirazione 5.
  3. Posizionare l'elettrodo stimolante il primo piatto per evitare vibrazioni quando l'elettrodo intracellulare è a posto. Posizionare l'elettrodo stimolante in prossimità del neurone motore innervano muscoli 6 e applicare delicata aspirazione fino a quando il nervo taglio è all'interno della pipetta di vetro. Fare attenzione a non allungare i nervi quando l'aspirazione viene applicata. Sollevare la pipetta leggermente in modo che non tocchi il muscolo e posizionarla in modo che non è tirando le fibre nervose taglio (Figura 2).
    Figura 2
    Figura 2. Uno schema della muscolatura e motoneuroni innervano di un segmento addominale dalla larva di Drosophila. La posizione della pipetta stimolante e reciso i nervi e l'elettrodo di registrazione in posizione muscolare 6 sono illustrati.
  4. Intraregistrazioni cellulari sono realizzate con i microelettrodi affilato pieno di 3 M KCl. Posizionare l'elettrodo di registrazione sopra il centro del muscolo 6 sul terzo segmento addominale (A3) e regolare l'ingresso di offset in modo che legga zero per la soluzione del bagno. Abbassare lentamente l'elettrodo e l'approccio al muscolo sotto alto ingrandimento ottico fino a toccare la superficie del muscolo. Guarda l'oscilloscopio per confermare che il muscolo è stato penetrato. Il potenziale di membrana a riposo deve essere di almeno -60 mV, o l'animale non deve essere utilizzato. Sporadici potenzialità placca in miniatura dovrebbe essere visibile. Lasciare la cella di stabilizzare per un minuto prima di iniziare a registrare.
  5. Variazioni del potenziale di membrana vengono rilevati con un HS-2A stadio testa Axon e un amplificatore 2B Axoclamp e registrato con CLAMPEX v 8.2.0.235 (Axon Instruments). La 2B Axoclamp è interfacciato con un computer che esegue software pCLAMP e lavora in congiunzione con l'interfaccia Digidata 1322A.
  6. Le cellule sono state registrate per 3 minuti senza nessuno stimolo a misurare le risposte mEJP. Le tracce sono state analizzate utilizzando un software di analisi Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) e l'ampiezza e la frequenza mEJP determinato.

La stimolazione del nervo:

  1. La fine reciso del neurone motore viene stimolato con una serie di impulsi di tensione quadrati (0,3 ms di durata) con un'intensità che è sufficiente per entrambe le assoni motori, per evocare risposte coerenti in tutto il muscolo.
  2. Lo stimolo viene generato con il Maestro-8 generatore di impulsi, che è programmato per fornire impulsi continuamente a seconda della durata e tempi di intervallo.
  3. Lasciate cinque secondi tra gli stimoli per il recupero sinaptico al NMJ.
  4. Nel determinare l'intensità dello stimolo, iniziare con il più basso livello e aumentare l'intensità lentamente diverse prove. L'intensità dello stimolo minimo che si traduce in una risposta evocata deve essere utilizzato negli esperimenti.
  5. Quando l'intensità dello stimolo appropriato è raggiunto, ci dovrebbe essere una EJP composto e una contrazione muscolare evocata dallo stimolo.
  6. Record di almeno 10 potenziali evocati da ogni muscolo e media le ampiezze.

Parte 3: Risultati Rappresentante

figura 3
Figura 3. Rappresentante registrazione intracellulare dal muscolo 6 mostra la evocato EJP è risposta alla stimolazione elettrica del nervo segmentale, e le potenzialità sporadici placca in miniatura, o di mEJP. Ampiezze EJP nel muscolo 6 di sano wild-type larve, come il Canton S, sono in genere circa 40 mV e le ampiezze mEJP tra 1-3 mV.

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Discussion

I metodi descritti qui forniscono un modo relativamente rapido e ampio per rilevare i cambiamenti nella funzione sinaptica alla NMJ. La possibilità di effettuare registrazioni elettrofisiologiche su animali intatti in vivo, ed eseguire manipolazioni genetiche o farmacologiche, fanno Drosophila un modello animale ideale per indagare gli aspetti fisiologici e genetici della neurotrasmissione.

Dato che le cellule muscolari sono molto grandi, qualcuno potrebbe preferire di aggiungere un ulteriore passaggio di questo protocollo per due elettrodi di tensione morsetto (TEVC) di registrazione. Questo può essere effettuata sulla preparazione stessa larvale con l'elettrodo in posizione intracellulare, posizionando una corrente che passa elettrodi della cella. Una volta che la cella è sufficiente tensione bloccato, la risposta corrente può essere registrato.

Sebbene muscolare 6 è il più comunemente usato per le registrazioni elettrofisiologiche, i muscoli 7 e 12 può essere utilizzato anche.

I metodi descritti qui mostrare gli elementi essenziali della Drosophophila NMJ elettrofisiologia - tecniche che sono stati descritti da Jan e Jan nel 1976, e da allora diventato il modello di sistema per la ricerca di fisiologia sinaptica.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Small Petri dishes (35 x 10 mm) BD Biosciences 1008
SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 3097366-1004
Dissecting microscope Carl Zeiss, Inc. 475002-9902
Light for microscope Schott AG KLI500
Dissection pins Fine Science Tools 26002-10
pClamp 9 software Molecular Devices PCLAMP 9 STANDARD
Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-0
Dumont SS Forceps Fine Science Tools 11200-33
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in) World Precision Instruments, Inc. TW100F-4
Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in) World Precision Instruments, Inc. 1B120F-4
Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller Sutter Instrument Co. Model P-2000
Pipette polisher Narishige International MF-83
Axon HS-2A head stage Molecular Devices Model HS-2A
Micromanipulators Sutter Instrument Co. MP-85
Axoclamp 2B amplifier Molecular Devices AXOCLAMP 2B
Clampex Software Molecular Devices v 8.2.0.235
Mini analysis software. v 6.0.3 Synaptosoft
Brownlee Precision Amplifier Brownlee Model 410
NaCl Baker/VWR 4058-01
KCl Sigma-Aldrich p-9333
NaHCO3 Sigma-Aldrich s6297-1kg
Trelahose Sigma-Aldrich TO167
Sucrose Fisher Scientific bp220-212
HEPES Sigma-Aldrich h-3375
MgCl-6H2O Sigma-Aldrich m2670-1kg
CaCl2 Fisher Scientific c79-500
Master-8 Pulse Generator A.M.P.I
Vibration table for electrophysiology set up Technical Manufacturing Corp.
Faraday Cage

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References

  1. Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. J. Neurobiol. 24, (8), 1008-1024 (1993).
  2. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, (2), 377-402 (2004).
  3. Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).
  4. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Protocol for dissection of Drosophila larvae. J Vis Exp. (2008).
  5. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).
  6. Katz, L. C., Shatz, C. J. Synaptic activity and the construction of cortical circuits. Science. 274, 1133-1138 (1996).

Comments

1 Comment

  1. Hi,   I read your article and I think it´s very good. My question is technical. I am trying to assemble an intracellular recording set up with a similar equipment that you have. I am a beginner in this field and I which to understand how things connect each other. For example, how do you connect the stimulator to the digidata and this to the computer; and it works with clampex protocol.   Please if you can help me. I am really thank you   best regards   Henrique Silva, MSc, PhD in Physiology Oporto University

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 27, 2009 - 10:30 AM

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