Neurocircuit Assays में मिरगी म्यूटेंट की बरामदगी के लिए ड्रोसोफिला

Biology

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Summary

उच्च आवृत्ति जब्ती की तरह बिजली की उत्तेजना गतिविधि, का उपयोग में प्रेरित किया जा सकता है

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Howlett, I. C., Tanouye, M. A. Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila. J. Vis. Exp. (26), e1121, doi:10.3791/1121 (2009).

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Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर गतिविधि की तरह जब्ती के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है. म्यूटेंट की एक किस्म है जिसमें बरामदगी या तो शारीरिक आघात या बिजली की उत्तेजना के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है जब्ती गतिविधि और व्यवहार के विभिन्न पहलुओं के अध्ययन के लिए उपलब्ध है. जंगली प्रकार सहित सभी मक्खियों, जब्ती तरह गतिविधि से गुजरना अगर एक पर्याप्त उच्च वोल्टेज में उत्तेजित जाएगा. जब्ती गतिविधि की तरह एक प्रतिक्रिया सभी या कुछ भी नहीं है और प्रत्येक जीनोटाइप एक विशिष्ट जब्ती दहलीज है. मक्खी के एक विशिष्ट जीनोटाइप की जब्ती दहलीज या आनुवंशिक दमन या बढ़ाने के द्वारा एक दवा के साथ इलाज के द्वारा या तो बदल सकते हैं. दहलीज इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा आसानी से मापा जाता है. जब्ती गतिविधि की तरह उच्च आवृत्ति बिजली के मस्तिष्क को सीधे दिया और छाती में पृष्ठीय अनुदैर्ध्य मांसपेशियों (DLMs) के माध्यम से दर्ज उत्तेजना के माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है. DLMs विशाल फाइबर प्रणाली के भाग के द्वारा innervated कर रहे हैं. कम वोल्टेज, उच्च आवृत्ति उत्तेजना के साथ शुरू, और बाद में छोटे वेतन वृद्धि में वोल्टेज बढ़ाने, एक एकल मक्खी के लिए जब्ती दहलीज मापा जा सकता है.

Protocol

नमूना तैयार करना:

प्रयोग से पहले रात, वांछित जीनोटाइप के पुरुष मक्खियों anesthetized और एक नरम नायलॉन प्लग के साथ एक शीशी में रखा जाता है. एक कपास की गेंद भी काम करेगा. Anesthetization के बाद, जब्ती दहलीज बदल दिया है, तो मक्खियों का सबसे अच्छा कम से कम 6 घंटे के लिए छोड़ दिया जाता है, हालांकि रात आदर्श है.

प्रयोग के दिन पर, एक तरफ दंत मोम की एक परत के साथ मक्खियों गिलास स्लाइड के लिए एक समय में एक बढ़ रहे हैं.

एक एकल मक्खी एक 23 गेज सुई (काट तेज टिप के साथ) एक निर्वात लाइन से जुड़ी का उपयोग कर सिर से उठाया है.

मक्खी तो मोम में पैर और पंखों को धक्का द्वारा स्लाइड पर मोम चिपका है.

एक बार मक्खी immobilized है, मोम गर्दन के चारों ओर धकेल दिया है और आँखों को पूरी तरह से सिर को स्थिर करने के लिए.

इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी:

मक्खी, जो अब मुहिम शुरू की है और जाने के लिए तैयार है इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में रखा सेट अप.

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सेट अप micromanipulators के तीन सेट, दो तेज टंगस्टन जुड़े इलेक्ट्रोड के साथ प्रत्येक के होते हैं. वोल्ट एक उत्तेजक औधधि है कि उत्तेजक इलेक्ट्रोड से जुड़ी एक अलग इकाई के लिए जुड़ा हुआ है द्वारा प्रदान की गई है. रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक पूर्व amp जो बारी में एक डिजिटल भंडारण आस्टसीलस्कप से जुड़ा हुआ है जुड़ा हुआ है. हालांकि यह जरूरी नहीं है, यह उपयोगी है के लिए एक आस्टसीलस्कप प्रतिक्रियाओं इतना है कि श्रव्य बनाया जा सकता है के लिए कांटे की शकल वक्ता है.

जमीन इलेक्ट्रोड मक्खी के पेट में डाला जाता है.

रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड एक मक्खी की छाती में पृष्ठीय अनुदैर्ध्य मांसपेशियों में डाला जाता है.

उत्तेजक इलेक्ट्रोड दिमाग में डाला जाता है. प्रत्येक आँख के पक्ष में.

प्रत्येक नाड़ी के बीच 2 सेकंड के साथ सतत पल्स अंतराल: उत्तेजक औधधि शुरू करने के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स होना चाहिए. वहाँ कोई पल्स देरी होना चाहिए. पल्स चौड़ाई 0.2ms होना चाहिए.

आस्टसीलस्कप भंडारण सुविधा चालू है और निम्नलिखित सेटिंग्स है: 1ms/DIV समय / DIV के लिए सेट किया जाना चाहिए. वोल्ट / DIV या तो 0.1V/DIV या 50 mV / DIV पर सेट किया जाना चाहिए.

विशाल फाइबर दहलीज एकल दालों पहुंचाने और एक प्रतिक्रिया पाने के लिए आवश्यक न्यूनतम वोल्टेज टिप्पण द्वारा निर्धारित किया जाता है. इस वोल्टेज 2 के आसपास आम तौर पर वी.

एक बार विशाल फाइबर सीमा निर्धारित किया गया है, मक्खी स्पंदन बंद करो और आस्टसीलस्कप पर सेटिंग्स बदलने के लिए: 0.2 एस / DIV

उत्तेजक औधधि पर सेटिंग्स को परिवर्तित किया जाना चाहिए: पल्स अंतराल एकल करने के लिए सेट किया जाना चाहिए. ट्रेन पर दिया जाना चाहिए और 3 सेकंड के लिए सेट. तरंग पैरामीटर हैं: 0.5 200Hz पर 300 एमएस के लिए एमएस दालों. वोल्टेज वांछित सेटिंग और दालों के उच्च आवृत्ति एक ट्रेन है मक्खी के मस्तिष्क के लिए दिया है करने के लिए बदल जाता है.

यदि एक जब्ती प्रेरित नहीं है, आस्टसीलस्कप ट्रेस ट्रेन के बाद एक फ्लैट लाइन दिखाएगा. यदि सेटिंग्स जल्दी शुरू सेटिंग्स वापस स्थापित कर रहे हैं, एकल दालों विशाल फाइबर प्रणाली में एक प्रतिक्रिया कारण होगा.

यदि एक जब्ती प्रेरित है, आस्टसीलस्कप ट्रेन के बाद जब्ती की तरह गतिविधि दिखा देंगे. यदि सेटिंग्स जल्दी से मूल सेटिंग्स को वापस स्विच कर रहे हैं, एकल दालों विशाल फाइबर प्रणाली में एक प्रतिक्रिया सक्रिय असफल हो जायेगी.

मक्खियों उच्च आवृत्ति एक उत्तेजना wavetrain जिसमें गतिविधि की तरह जब्ती प्रेरित नहीं किया जा सकता है के बाद एक दुर्दम्य अवधि है. यदि कोई जब्ती होता है मक्खियों लगभग 7 मिनट के लिए आग रोक रहे हैं. यदि एक जब्ती प्रेरित है, मक्खियों लगभग 17 मिनट की एक दुर्दम्य अवधि है.

जब दहलीज का निर्धारण, अतिरिक्त उच्च आवृत्ति उत्तेजनाओं ही मक्खी (दुर्दम्य अवधि के लिए उपयुक्त समय के बाद) के लिए दिया जा सकता है जब तक निर्धारित दहलीज या है जब तक विशाल फाइबर प्रतिक्रिया को देखने के भी कमजोर हो जाता है.

प्रयोग के बाद पूरा हो गया है, मक्खी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी से निकाल दिया जाता है की स्थापना की, मोम से जारी है, और का निपटारा.

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Discussion

यह वीडियो एक व्यक्ति ड्रोसोफिला मक्खी की जब्ती दहलीज को निर्धारित करने में बुनियादी कदम का प्रदर्शन किया है. डिजिटल आस्टसीलस्कप का उपयोग करने के बजाय, एक कम्प्यूटरीकृत digitizer भी इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक को एक दवा या एक मक्खी की जब्ती दहलीज पर आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उपयोगी है.

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Acknowledgments

यह काम एक NIH अनुसंधान अनुदान, एक मिरगी फाउंडेशन अनुदान और एक McKnight फाउंडेशन अनुदान ड्रोसोफिला फल मक्खियों पर मीट्रिक टन प्रयोगों के लिए UC बर्कले पशु उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार प्रदर्शन किया गया द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital oscilloscope Hitachi VC-6523
Stimulator Cornerstone S-900
Preamplifier World Precision Instruments, Inc. Electro 705
Micromanipulators Narishige International various

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References

  1. Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
  2. Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
  3. Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).

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