のてんかんの変異体における発作のためのアッセイをNeurocircuitショウジョウバエ

Biology

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Summary

使用して、高頻度電気刺激、発作のような活動がで誘導することができる

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Howlett, I. C., Tanouye, M. A. Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila. J. Vis. Exp. (26), e1121, doi:10.3791/1121 (2009).

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Abstract

キイロショウジョウバエの活動のような発作を研究するための便利なツールです。発作が物理的な衝撃や電気的刺激のいずれかを介して誘導することができる変異体の様々な発作活動と行動のさまざまな側面の研究のために使用可能です。十分に高い電圧で刺激した場合、野生型を含むすべてのハエは、発作のような活動を受けることになる。活動のような発作は、全か無かの応答であり、各遺伝子型は、特定の発作閾値を持っています。ハエの特定の遺伝子型の発作閾値はいずれかの薬物による治療によって、または遺伝的抑制または機能の拡張によって変更することができます。しきい値が容易に電気生理学によって測定されます。発作様活性は、胸部の背側縦筋(DLMS)を介して脳に直接配信されると記録された高頻度の電気刺激により誘導することができる。 DLMSは、巨大な光ファイバシステムの一部によって神経支配されています。低電圧、高周波の刺激から始まり、その後少しずつ電圧を上げ、単一のフライ用の発作閾値を測定することができます。

Protocol

試料の調製:

実験前の晩には、目的の遺伝子型の雄のハエを麻酔し、ソフトなナイロンプラグ付きバイアルに配置されます。コットンボールにも働くだろう。麻酔の後、発作閾値が変更され、一晩理想的ですがハエが最高、少なくとも6時間放置されていますので。

実験日に、ハエは片側歯科ワックスの層をガラススライドに1つずつ搭載されている。

単一のフライは、真空ラインに接続された23ゲージの針を(カットオフ鋭い先端を持つ)を使用して頭に拾われる。

フライは、ワックスに足と羽を押すことにより、スライド上のワックスに貼付されています。

フライが固定化されると、ワックスが完全に頭部を固定するために首や目の周りを押し上げている。

電気生理学:

現在マウントされていると行って準備ができて電気生理学的に配置されているフライは、設定する。

電気生理学のセットは、最大マイクロマニピュレータの3セット、接続されている2つの尖ったタングステン電極への1つでそれぞれ構成されています。電圧は、刺激電極に接続された分離ユニットに接続されている刺激によって提供されます。記録電極は、順番に、デジタルストレージオシロスコープに接続されているプリアンプに接続されています。それは本質的ではありませんが、それは、応答が聞こえるが行われるようにオシロスコープにフックアップするスピーカーがあると便利です。

接地電極は、ハエの腹部に挿入されます。

記録電極は、ハエの胸部の背側縦筋のいずれかに挿入されます。

刺激電極は頭部に挿入されます。それぞれの眼の側に一つ。

各パルスの間に2秒で連続パルスの間隔を:刺激装置は、次の設定を開始する必要があります。はパルスの遅延はないはずです。パルス幅は、入力サージでなければなりません。

オシロスコープは、ストレージ機能がオンになっていると、次の設定が必要です:時間/ DIVは1ms/DIVに設定する必要があります。ボルト/ DIVは0.1V/DIVまたは50 mV / divのどちらかで設定する必要があります。

巨大な繊維のしきい値は、単一のパルスを供給し、応答を得るために必要な最小限の電圧に注目することによって決定されます。この電圧は、およそ2通常はVです。

巨大な繊維のしきい値が決定されると、その場にパルスを停止し、オシロスコープの設定を変更する:0.2 S / DIV

刺激の設定は次のように変更する必要があります。パルス間隔は、単一に設定する必要があります。電車の電源が入っていて、3秒に設定する必要があります。波形パラメータは次のとおりです:300ミリ秒のための200Hzの0.5 msのパルス。電圧を所望の設定に変更され、パルスの高周波列車は、ハエの脳に配信されます。

発作が誘発されていない場合は、オシロスコープのトレースは、列車の後に平らな線が表示されます。設定がすぐに開始する設定に戻す設定されている場合、単一のパルスは、巨大な繊維系の応答の原因となります。

発作が誘発されている場合、オシロスコープは列車の後に発作のような活動が表示されます。設定はすぐに元の設定に戻している場合は、単一パルスは巨大な繊維系の応答を有効にするために失敗します。

ハエは、活動のような発作が誘発されることができる高周波刺激wavetrain後に不応期を持っている。は発作が発生しない場合ハエは約7分間耐火です。発作が誘発されている場合は、ハエは約17分の不応期を持っている。

巨大な光の応答に見て弱すぎになるまでしきい値が決定されるまで、またはしきい値を決定する際に、追加の高周波刺激は同じフライ(不応期のための適切な時間後)に配信することができます。

実験が完了すると、フライは電気生理学から削除設定し、ワックスから解放され、処分される。

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Discussion

このビデオでは、個々のショウジョウバエのハエの発作の閾値を決定する際の基本的な手順を実証してきました。代わりにデジタルオシロスコープを使用する代わり、コンピュータ化されたデジタイザを使用することもできます。このテクニックは、ハエの発作閾値に対する薬剤または遺伝子改変の効果を判断するのに便利です。

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Acknowledgments

この作品は、カリフォルニア大学バークレー校動物使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行われたショウジョウバエショウジョウバエでMTの実験にNIHの研究助成金、てんかん財団の助成金とMcKnight財団の助成金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digital oscilloscope Hitachi VC-6523
Stimulator Cornerstone S-900
Preamplifier World Precision Instruments, Inc. Electro 705
Micromanipulators Narishige International various

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References

  1. Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
  2. Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
  3. Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).

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