בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

השגת איכות גבוהה וכמות נאותה של איים האנושי הוא אחד התנאים המוקדמים הבולטים איון להשתלה מוצלחת. בסרטון הזה, אנו מתארים צעד אחר צעד את נוהלי בידוד איון האדם הלבלב (אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב) בשיטה אוטומטית שונה.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניהול של סוכרת מסוג 1 היא מעיקה, הן הפרט והחברה, עולה מעל 100 מיליארד דולר בשנה. למרות השימוש הנרחב של ניטור גלוקוז אינסולין ניסוחים חדשים, אנשים רבים עדיין לפתח סיבוכים משניים הרסנית. איון השתלת הלבלב יכול לשחזר ליד בקרת גלוקוז נורמלי אצל חולי סוכרת

Protocol

1. מתקן התקנה

  1. בידוד איון אדם היא הליך רגיש הזמן הכרוך בעבודת צוות, ומכאן, ארבעה בני אדם יש צורך לנהל הליך זה. הקבוצה היא להוביל על ידי המנתח, אשר מנתח ו cannulates את הלבלב.
  2. הבידוד איון מתחיל ברגע הצוות נכנס למתקן UIC בידוד איון. חברי הצוות להבטיח כי כל המכשור הדרוש, כמו צנטריפוגה, הוא בדק מופעלת. הם גם דואגים לטהר את כל ברדסים ומשטחים.
  3. שני אנשים יהיה להגדיר את הטבלה cannulation, מכונת ברד, מעגל העיכול, יחידת זלוף, מכונת טיהור COBE, ושולחנות כירורגית.
  4. במקביל, שני חברי צוות אחרים יכין התקשורת כי יש צורך במהלך הבידוד.
  5. בשלב הבא, צינורות בקטריולוגיה (בקבוקים, צינור, הטופס שקית), צינורות דגימה (טרום מלא לשטוף), צינורות הערכה וצלחות מוכנים.
  6. הכן את הצינור טיהור להגדיר כדלקמן: 1 שפופרת ריק מסומן ב 150 מ"ל, צינורות 2-12 מלא 200 מ"ל של M199 התקשורת בתוספת (פתרון לשטוף) אלבומין אנושי ומסומן ב 230 מ"ל, ולבסוף אחד 50 מ"ל צינור חרוטי מלאות 50 מ"ל של תמיסת לשטוף. לאחר השלבים הושלמו ההכנות אנחנו מוכנים להתחיל בהכנת המרוססת את הלבלב.

2. לבלב הכנה זלוף

  1. כדי להתחיל הכנה זלוף של הלבלב, מפעיל מסיר את איבר מן האריזה באמצעות טכניקה סטרילית. המנתח תעביר את הלבלב לשולחן טיהור.
  2. המנתח יהיה למלא את אחד 60 מ"ל מזרק עם הפתרון המקורי שימור הלבלב לעומת זאת למפעיל, מי יהיה להשתמש בו כדי למלא מוכן "רכש" בקבוקים בקטריולוגיה.
  3. לאחר בדיקה ויזואלית כדי לקבוע אם איבר מתאים בידוד איון (אם הלבלב נפגע במהלך הרכש או חריג מבחינה אנטומית, זה לא יכול לשמש לבידוד איון), המנתח יבקש מפעיל להכין collagenase. זכרו כי הזמן מחדש ההשעיה משתנה בין המותגים אנזים והרבה שונה.
  4. כאשר המנתח מוכן, להביא את פתרונות טיהור (בבטאדין, Fungizone / Cefazolin ו HBSS) לשולחן טיהור ויוצקים אותם לתוך המכולות המתאימות. המנתח מבצע טיהור הלבלב כביסה לרגע את הלבלב בכל פתרון טיהור. הלבלב ממוקם אז בצנצנת סטרילית קטן שבו יהיה שקל. לאחר משקל ברשומה אצווה, הלבלב ממוקם במחבת cannulation עם פתרון כמה לשימור.
  5. המנתח יחשוף באופן חלקי לחתוך את צינור הראשי cannulate כל חצי של הלבלב עם הצינורית. הצינורית יהיה מאובטח על ידי תפר. כדי perfuse הלבלב, תחילה להעביר אותו ליחידה זלוף ויוצקים את הפתרון האנזים לתוך הכיור. זמן זלוף סה"כ כ 10 דקות, 80 מ"מ כספית במשך 5 דקות, ולאחר מכן ב 180 מ"מ כספית במשך 5 דקות. לבלב נפוחה לאחר זלוף.
  6. הזז את הלבלב perfused לסיר cannulation, שבו רקמת שומן חיתוך מהלבלב בזהירות. ואז לחתוך את הלבלב לתוך 10-12 חתיכות להעביר Ricordi לשכת לעיכול.

3. הלבלב לעיכול

  1. כדי להתחיל צעד העיכול, להעביר את הלבלב אל לשכת Ricordi ריקה, להוסיף 2.5 מ"ל בבקבוקון של Pulmozyme, לשים על המסך (למנוע נתח גדול של גוש הרקמה קאמרית), לסגור את החדר, ולמלא את המערכת.
  2. התחל שאיבה הפתרון במשך 5 דקות. בעדינות את הסלע קאמרית כדי לפזר באופן שווה פתרון חמים לאורך כל הדרך. אחרי חמש דקות, בעדינות לנער את החדר עבור השלב העיכול כולו. שמירה על טמפרטורה ב 37 ˚ C.
  3. הסלע קאמרית בעדינות עד הטמפרטורה מגיעה ל 37 מעלות, ואז ללחוץ את החדר. קח דוגמה כל שתי דקות לזהות אם איים חינם נמצאים תחת היקף. תעדו את המידע הערכה איון בטבלה העיכול של הרשומה אצווה. המשך לעקוב אחר אחוז עד איים יש 50% מהם צף חופשי מבודד הפתרון.

4. רקמות אוסף

  1. לאחר 50% איים נמצאים חופשי בדגימות, עיכול הוא נעצר על ידי הוספת קר פתרון RPMI דילול במעגל. רקמות נאסף 500 מ"ל צינורות חרוטי טרום מלא 30 מ"ל אלבומין אדם. לאחר הצינורות הם הסתחררו, היניקה את supernatant לשטוף את הכדור עם פתרון לשטוף קר. ספין צינורות חרוטי ב 1100 סל"ד (סיבובים לדקה) עבור 1 דקה, 4 ˚ C.
  2. מערבבים את כל צינורות האיסוף תלוי עם רקמת לבלב מעוכל לתוך יחידה 500 מ"ל חרוטי. כאשר צינור מלא של רקמות שטף, ספין לחזור על התהליך עד שכל רקמת כביסה נחפף מספר פעמים. ספין זה צינור העברת רקמות לתוך צינור אחד מ"ל 250 חרוטי. תביאו את נפח של עד 250 מ"ל עםM199 פתרון כביסה בתוספת HA ולהתכונן הדגימה.
  3. קח דוגמה 1 מ"ל עם טפטפת ולהוסיף צינור מ"ל 15 חרוטי מראש מלא 9 מ"ל של תמיסת לשטוף. ואז לערבב ידי צינור חרוטי היפוך בעדינות 15 מ"ל ומתוך זה, מתוך מדגם 1ml ישירות לתוך צלחת רשת סופר. ספירת תאים, לחשב את מספר הסלולרי באמצעות גורם לדילול של 2500 (10x250).
  4. ספין הצינור 250 מ"ל חרוטי ולהוסיף 150 מ"ל של UW (אוניברסיטת ויסקונסין) פתרון שבדרך כלל להשתמש לשימור איברים. כאשר UW הוא הוסיף, לערבב את ההשעיה התא ביסודיות בעזרת פיפטה. שיא ולתקשר למפעיל טיהור הזמן להתחיל UW. השאירו את הצינור (ים) על הקרח מערבולת מדי פעם. עכשיו איים ניתן מטוהרים נוספת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מגוון גורמים המשפיעים על התוצאה בידוד 9,10. ביניהם, עיכול של רקמת הלבלב תפקיד בולט. בהתבסס על הניסיון שלנו איון אדם בבידוד, סיכמנו הבאים נקודות קריטיות, אשר עלול להשפיע על איכות תשואה איון ו.

  1. זמן עיכול שונה, כאשר סוגים שונים של אנזימים מנוצלים.
  2. ברגע 40-50% של איים המופרדים לגמרי מן הרקמה acinar, העיכול יש להפסיק באופן מיידי על ידי הוספת פתרון דילול וקירור את הרקמה.
  3. הטיפול העדין של הרקמה בעת איסוף, כביסה, ערבוב.
  4. תערובת של רקמות שנאספו UW הפתרון צריך להיות ממוקם על קרח למשך 30 דקות לפחות כדי להשיג תוצאה טובה יותר לטיהור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

נתמכים על ידי מימון מאוניברסיטת אילינוי בשיקגו, כמו גם משאבים איילט Cell מרכז NIH מענק (RFA-RR 05-003), קרן כריסטופר, קרן Efroymson, וקרן Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).

Comments

9 Comments

  1. Nice video, Barbara. I learned a lot.

    Tatsuya from Edmonton

    Reply
    Posted by: Tatsuya K.
    May 28, 2009 - 7:34 PM
  2. Thank you tatsuya

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 7:45 PM
  3. i am from taiwan, a transplant surgeon. it is very impressive to see this video and really learn a lot! appreciate your kindly share!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2009 - 12:28 PM
  4. if you want to learn, please let us know. Really appreciate your comments. Yong

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2009 - 1:02 PM
  5. I also think this video is very helpful. I just joined as a research assistant at an islet transplant lab in Canada. I just wish I could download the movie to view it more often.

    Reply
    Posted by: Marco G.
    October 31, 2010 - 7:20 PM
  6. Thanks for your comments. You can subscribe and download the movie from the web.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2010 - 10:07 AM
  7. Great video! Definitely very helpful in visualizing the protocol. Are you able to provide any additional information on the perfusion unit set up?

    Reply
    Posted by: Brooke L.
    December 12, 2012 - 11:50 AM
  8. Hello Brooke L, thank you so much for sending this massage and being interested in our human islet isolation protocol. I can certainly provide more information and discuss the perfusion unit set up. Please send us an email about what exactly you want to know. We are happy to give more explanations. Thanks

    Reply
    Posted by: Meirigeng Q.
    December 12, 2012 - 2:44 PM
  9. Hi, really nice video. I´m from Brazil and we are close to start our Islet Transplant Program. Still struggling with some issues in the isolation phase.
    I have a question. When you prepare the colagenese do you use Pulmozine together and also in the chamber?
    And the ficoll is prepared with HBSS or UW or Eurocollins?
    Thank you
    I appreciate your help.

    Reply
    Posted by: Andrea Carla B.
    August 15, 2014 - 9:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics