İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz

Protocol

1. Tesis kurulum

  1. İnsan adacık izolasyonu, takım çalışması gerektirir bir zaman hassas bir işlemdir ve bu nedenle, dört kişi bu işlemi yapmak için ihtiyaç vardır. Takım masaya ve pankreas cannulates cerrah tarafından yönetilmektedir.
  2. Adacık izolasyon ekibi UIC adacık izolasyonu tesisi girer dakika başlar. Ekip üyeleri, santrifüj gibi, gerekli tüm enstrümantasyon, kontrol edilir ve açık olduğunu emin olun. Ayrıca, tüm davlumbaz ve yüzeyleri sterilize etmek için emin olun.
  3. İki kişi kanülasyon tablo, sulu kar makinesi, sindirim devre, perfüzyon ünitesi, COBE arıtma makine ve cerrahi masaları kuracak.
  4. Aynı zamanda, diğer iki ekip üyeleri, izolasyon sırasında gerekli ortam hazırlayacaktır.
  5. Sonra, bakteriyoloji tüpleri (şişe, tüp, form ve çanta), numune alma tüpleri (ön yıkama ile dolu) ve değerlendirme tüpleri ve plakaları hazırlanır.
  6. Aşağıdaki gibi ayarlayın arıtma tüpü hazırlayın: 1. tüp boş ve 150 ml işaretli, tüpler 2-12, 200 ml insan albumini (yıkama solüsyonu) ile desteklenmiş M199 medya ile doldurulmuş ve 230 ml 'işaretli, ve nihayet 50 ml konik tüp 50 ml yıkama solüsyonu ile doldurulur. Bu hazırlık adımları biz hazırlanması ve pankreas perfüze başlamaya hazır tam.

2. Pankreas hazırlanması ve perfüzyon

  1. Hazırlanması ve pankreasın perfüzyon başlamak için, bir operatör, steril tekniği kullanarak ambalaj organ kaldırır. Cerrah dekontaminasyon tablo pankreas transfer olacak.
  2. Cerrah orijinal pankreas koruma çözümü ve hazırlanan "İhale" bakteriyoloji şişeleri doldurmak için kullanan bir operatörü, el ile bir adet 60 ml şırınga dolduracaktır.
  3. Organ adacık izolasyonu (pankreas, satın alma sırasında hasar veya anatomik olarak anormal ise, adacık izolasyonu için kullanılan) için uygun olup olmadığını belirlemek için bir görsel denetim sonra, cerrah kollajenaz hazırlamak için bir operatör soracaktır. Yeniden askıya alınması zaman farklı enzim marka ve birçok arasında değişmektedir unutmayın.
  4. Cerrah hazır olduğunda, dekontaminasyon tablo (Betadine, Fungizone / Sefazolin ve HBSS) dekontaminasyon çözümler getirmek ve onlara uygun kaplar içine dökün. Cerrah, bir dakika için her dekontaminasyon çözüm pankreas pankreas yıkama dekontaminasyon gerçekleştirir. Pankreas sonra tartılır olacağı küçük steril bir kavanoza konur. Ağırlığı toplu kayıt içine girildikten sonra, pankreas, bazı koruma çözümü ile kanülasyon tavaya konur.
  5. Cerrah ortaya çıkarmak ve kısmen ana kanalı insizyon ve bir kanül ile pankreas her bir yarısı cannulate. Kanül dikiş tarafından temin edilecektir. Pankreas serpmek için, ilk perfüzyon ünitesi taşımak ve enzim çözeltisi havza içine dökün. Toplam perfüzyon süresi 5 dakika için 180 mmHg, sonra 5 dakika süreyle 80 mmHg, yaklaşık 10 dakika. Pankreas perfüzyon sonra şişmiş.
  6. Kanülasyon tavaya yağ dokusu, pankreas dikkatli bir şekilde kesilmiş perfüze pankreas, taşıyın. Sonra 10-12 parçalar halinde kesilmiş ve pankreas sindirim için Ricordi Odası transfer.

3. Pankreas sindirim

  1. Sindirim adım başlamak için, boş Ricordi Odası pankreas aktarmak, ekranda koymak Pulmozyme 2.5 ml şişe, (odası doku blok büyük bir yığın önlemek) eklemek, oda kapatın ve sistemi doldurun.
  2. 5 dakika boyunca çözüm pompalama başlayın. Odanın sıcak bir çözüm boyunca eşit dağıtmak için hafifçe sallayın. Beş dakika sonra, tüm sindirim aşaması için odasına yavaşça sallayın. 37 ° ˚ C sıcaklık koruyun
  3. Rock odasının sıcaklığı 37 °, sonra odasına sallamak ulaşıncaya kadar yavaşça. Bir numune alın ve her iki dakikada bir ücretsiz adacıklar kapsamında olup olmadığını algılayabilir. Toplu kayıt sindirim tabloda adacık değerlendirme bilgileri kaydedin. Adacık yüzdesi% 50 çözüm ücretsiz ve izole edilmiş yüzen kadar izlemeye devam edin.

4. Doku toplama

  1. Adacıklar% 50 örneklerinde bulunur, sindirim devresinde soğuk RPMI seyreltme çözüm ekleyerek durdurulur. Doku, 500 ml konik tüpler 30 ml İnsan Albumin ile önceden doldurulmuş toplanan. Tüpler emme süpernatantı kapalı döndü ve pelet soğuk yıkama solüsyonu ile yıkayın. 1 dakika, 4 ˚ C 1100 RPM (dakikadaki dönüş) konik tüpler Spin
  2. Tek bir 500 ml konik içine sindirilmiş pankreas dokusu ile askıya alma tüpleri birleştirin. Bir tüp, yıkanmış doku dolu olduğunda, spin ve tüm doku birden çok kez yıkanmış kadar yıkama işlemi tekrarlayın. Bu tüp spin ve tek bir 250 ml konik tüp içine doku transferi. 250 ml ile ses getirM199 yıkama solüsyonu HA ile desteklenmiş ve örnekleme için hazırlamak.
  3. Bir pipet yardımıyla 1 ml örnek alın ve önceden 9 ml yıkama solüsyonu ile dolu bir 15 ml konik tüp ekleyin. Daha sonra bir ızgara sayma çanak içine doğrudan 1ml dışarı yavaşça tersine 15 ml konik tüp ve bu örnek karıştırın. Hücre sayımı ve seyreltme faktörü 2500 (10x250) kullanarak hücre sayısını hesaplamak.
  4. 250 ml konik tüp Spin ve UW (Wisconsin Üniversitesi) genellikle organ korunması için kullanmak Çözüm 150 ml. UW eklendiğinde, pipet kullanarak hücre süspansiyonu iyice karıştırın. UW başlangıç ​​zamanını kaydedin ve arıtma operatörü iletişim. Buz ve bazen girdap tüp (ler) bırakın. Şimdi adacıklar arındırılmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Izolasyon sonucu 9,10 etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunların arasında, pankreas dokusu sindirim önemli bir rol oynar. Kendi insan adacık izolasyon deneyimine dayanarak, potansiyel adacık verim ve kaliteyi etkileyebilecek kritik noktaları, aşağıda özetlenmiştir.

  1. Enzimlerin farklı türleri kullanılmaktadır sindirim süresi farklı.
  2. En kısa sürede% 40-50 olarak asiner doku tamamen ayrılmış adacıklar, sindirim seyreltme çözüm ekleyerek ve doku soğuma derhal durdurulması olmalıdır.
  3. Doku Nazik taşıma, toplama, yıkama, ve karıştırma.
  4. Toplanan doku ve UW çözüm karışımı daha iyi saflaştırılması sonucu elde etmek için en az 30 dakika süreyle buz konulmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

University of Illinois at Chicago gibi Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı, Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı fon tarafından desteklenir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).

Comments

9 Comments

  1. Nice video, Barbara. I learned a lot.

    Tatsuya from Edmonton

    Reply
    Posted by: Tatsuya K.
    May 28, 2009 - 7:34 PM
  2. Thank you tatsuya

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 7:45 PM
  3. i am from taiwan, a transplant surgeon. it is very impressive to see this video and really learn a lot! appreciate your kindly share!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2009 - 12:28 PM
  4. if you want to learn, please let us know. Really appreciate your comments. Yong

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 14, 2009 - 1:02 PM
  5. I also think this video is very helpful. I just joined as a research assistant at an islet transplant lab in Canada. I just wish I could download the movie to view it more often.

    Reply
    Posted by: Marco G.
    October 31, 2010 - 7:20 PM
  6. Thanks for your comments. You can subscribe and download the movie from the web.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 1, 2010 - 10:07 AM
  7. Great video! Definitely very helpful in visualizing the protocol. Are you able to provide any additional information on the perfusion unit set up?

    Reply
    Posted by: Brooke L.
    December 12, 2012 - 11:50 AM
  8. Hello Brooke L, thank you so much for sending this massage and being interested in our human islet isolation protocol. I can certainly provide more information and discuss the perfusion unit set up. Please send us an email about what exactly you want to know. We are happy to give more explanations. Thanks

    Reply
    Posted by: Meirigeng Q.
    December 12, 2012 - 2:44 PM
  9. Hi, really nice video. I´m from Brazil and we are close to start our Islet Transplant Program. Still struggling with some issues in the isolation phase.
    I have a question. When you prepare the colagenese do you use Pulmozine together and also in the chamber?
    And the ficoll is prepared with HBSS or UW or Eurocollins?
    Thank you
    I appreciate your help.

    Reply
    Posted by: Andrea Carla B.
    August 15, 2014 - 9:45 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics