シナプス電位のChannelrhodopsin2仲介刺激でショウジョウバエ神経筋接合部

Published 3/16/2009
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Biology

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Summary

このプロシージャは、神経筋接合部(NMJ)の光パルスでシナプス電位を惹起する青色光活性化藻類チャネルと細胞特異的遺伝子発現のツールを使用しています

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Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (25), e1133, doi:10.3791/1133 (2009).

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Abstract

市販

Protocol

パート1:動物のケアと遺伝的交雑

  1. UAS - ChR2と標準のフライのメディア8を含む別のボトルにOK371 - GAL4フライラインを維持する。
  2. OK371 - GAL4フライラインとUAS - ChR2行の男性の処女を収集する。
  3. 1mMの全トランスレチナール(ATR)と混合標準フライメディアを含むバイアルに雄と雌の両方を置く。 ATR食べ物は〜1分間電子レンジで最初の溶融、通常のフライのメディアによってなされるべきである。一度溶けた、1分間に約30秒間の冷却し、ハエのメディアのすべての10 mlの100%EtOH中100mMのATRの100μlを追加することができます。その後、氷上に置きますバイアル、4で暗いエリアで店舗℃に
  4. ハエの仲間を聞かせて22から25に暗いエリアで産卵℃に
  5. 3齢幼虫が見えるようになるまで3-4日待って、その時点で、成人のハエ処分する。

パート2:リグのセットアップ

  1. 青色LEDへの10倍解剖スコープアイピース(我々の場合で、カールツァイス社、www.zeiss.com、ソーンウッド、ニューヨーク州から)、ヒートシンクの光源(トールラボ、www.thorlabs.com、ニュートン、ニュージャージー州を取り付けます)。ポストとクランプ付きマグネットベースに取り付けます。光源によって生成された電気的ノイズを減らすために電気的に接地されたシールドとヒートシンクをカバーしています。
  2. 電気生理学リグのエアテーブル上に光源のある場所マグネットベース。
  3. 回路を制御し、外部電圧源(Powerlab 4月30日、ADInstruments、www.adinstruments.com、コロラドスプリングズ、コロラド州)に制御回路を接続するための光源を接続してください。
  4. 青色光をアクティブにする回路を制御するために1 - 5Vのパルスを与える。
  5. 青色光ビームは幼虫の解剖によって占有される領域に焦点を当てされるまで、マグネットベースと光源を調整します。

パート3:解剖

  1. sylgardが並ぶ料理の床にカ所0.1ミリメートル虫ピン。
  2. ペトリ皿、プラスチックへの食品のメディアや場所から第3齢幼虫を削除します。
  3. 食べ物を削除するには生理食塩水で幼虫を洗浄します。
  4. プルピンの近くに皿を解剖し、½レベルに生理食塩水追加の場所の幼虫。
  5. オリエント幼虫は動物の背側表面に沿って実行している2つの銀色のチューブ(気管)を参照できるようにする。
  6. 気管チューブの間に尾に直接大きなピンを挿入します。縦に体を伸ばして確認してから、幼虫を押しながら、その頭に第二大ピンを配置します。
  7. 尾の近くに小さな切開を加える、と体の長さをそれを継続する。誤って腹神経および/または体壁の筋肉を切断しないようにハサミの先端がそのよう提起していることを確認します。
  8. 動物の四隅に置いて4本のピンは、現在開いている中央部です。フィレット動物をするように解剖皿にそれらを設定します。ピンの準備が出教えた。
  9. 鉗子やハサミを使用して、動物の内臓、気管および脂肪体を除去。
  10. 生理食塩水で準備をすすぐ。
  11. 前頭葉(図Aに見られる)と準備の腹側神経節を見つけます。
  12. マイクロはさみを使用して、慎重にちょうど前頭葉の後ろの腹側神経節を介してカット。

パート4:筋肉の記録と青色光の刺激

  1. 電子電極プラー(サッタインスツルメンツ)を使用して10月20日μω電極を引き出します。
  2. 3 M KClで引っ張ら電極を埋める。
  3. 場所は、電気生理学リグ上で解剖顕微鏡下で幼虫の予備校の近くにマイクロマニピュレータと電極ホルダーと操縦電極の先端に電極を埋め。
  4. 任意の体の壁のセグメント(図A)に筋6(M6)を識別する。
  5. 慎重にM6に電極を挿入し、迅速な過分極を監視します。筋肉静止膜電位は-30 mVから-70 mVにどこにする必要があります。
  6. 解剖準備が光ビームの中央になるように青い光を調整します。
  7. 回路を制御するために20から100ミリ秒の電圧パルスを与える。段階的に回路を制御するために供給される電圧を増加させる。筋細胞(図1B)における興奮性接合部電位を監視。

代表的な結果:

図1Aは、レコーディングのセットアップとフィレット作成の概略を示しています。図1Bは、短い光パルスにより誘発される典型的なEJPを示しています。示すように、EJPの振幅は、支配するM6の両方に知られている2つの運動ニューロンから振幅が​​加算される。より低い光強度のみアクティブに1つのモータユニット(データは示さず)。

図1

図1:細胞内記録のリグのと青色LED付き)一般的な回路図。脳(BR)は、腹側神経節(VG)のリズミカルな活性を阻害するために削除されます。 ChR2は、GAL4 - UASシステムを使用して運動ニューロンに発現している。 M6筋肉からB)細胞内記録。 40ミリ青色の光パルスは、(127μW/ mm 2の時)確実にM6に大きなシナプス電位(アスタリスク)を呼び起こす。

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Discussion

重要なステップは、筋細胞の初期の解剖と入力の両方を含む。最初の解剖中に神経が切断されたり、筋肉が損傷している場合には、実験の残りを継続することは困難である。解剖時に、1つは、背側切開中に可能な限り上方解剖ハサミを角度に非常に慎重でなければならない。筋細胞に入る第二の重要なステップ、中に、1つは、過去の過分極〜30 mVのために監視しなければなりません。 -30 mVの上記の値は、電極が筋肉の細胞内でまたは不健康な細胞に正しくどちらかではないことを示している。

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Disclosures

我々は、開示に関心の競合はありません。

Acknowledgements

この作品は、健康補助RO1GM - 33205およびLCグリフィスへMH - 067284の国民の協会によっておよびNJホーンスタインのブランダイス大学の夏学部研究奨学金によってサポートされていました。ウッズホール、マサチューセッツ州:このテクニックのための予備実験は、2008年ニューラルシステムと行動のサマーコース(R25 MH059472 NIMH助成金)の一環として、海洋生物学研究所で実施した。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Ellsworth Adhesives 4019862 www.ellsworth.com
Minutens Pins Fine Science Tools 26002-10 www.finescience.com
Dissecting Dish Fisher Scientific www.fishersci.com
Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage A-M Systems 680100 www.a-msystems.com
Powerlab 4/30 data acquisition system ADInstruments www.adinstruments.com
Grass stimulator Grass Technologies www.grasstechnologies.com
Desktop Computer Dell www.dell.com
Dissecting Scope Leica Microsystems www.leica-microsystems.com
Light Source Dolan-Jenner Industries 41446-062 www.dolan-jenner.com
Fly Media
All-Trans-Retinal Sigma-Aldrich 116-31-4 www.sigmaaldrich.com
OK-371 Gal4 Flies Bloomington Stock center
UAS-ChR2 Flies Fiala lab, Griffith lab
LED controller circuit Built in Griffith lab http://www.ledsupply.com
http://www.futureelectronics.com
Composed of:
1. 200 mA Buck Puck
2. Blue LED
3. Insulated wire
4. Circuit bread board
LED Heat Sink Thorlabs Inc. http://www.thorlabs.com/
Air Table TMC http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html
Faraday Cage Built in Griffith lab
Leica Leitz M Micro-Manipulator Leica Microsystems ACS01 www.leica-microsystems.com
Electrode Holder Axon Instruments www.axon.com
Borosilicate Glass FHC, Inc. www.fh-co.com/p14-15.pdf
Electrode Puller Sutter Instrument Co. www.sutter.com
HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ Contents (mM):
NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8
MgCl2:4Sucrose:115
NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES
Micro-Dissection Tools Fine Science Tools www.finescience.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
  2. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17, (1), 35 (2007).
  3. Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5, (4), e72 (2007).
  4. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15, (24), 2279 (2005).
  5. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940 (2003).
  6. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16, (17), 1741 (2006).
  7. Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14, (4), 707 (1995).
  8. Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).

Comments

1 Comment

  1. Hi Nicholas,

    A nice vido. I want to konw what model of light source did you use ? I could not find it by the Cata Num on the website.

    Thanks a lot.

    Kewen

    School of medicine Zhejiang University

    Reply
    Posted by: Jiang K.
    December 17, 2009 - 9:02 PM

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