प्लाज्मा और astrocytes में झिल्ली ग्लोबल intracellular कैल्शियम गतिशीलता के पास माप

Biology

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Summary

हम वर्णन करते हैं और सभ्य astrocytes में कुल आंतरिक प्रतिबिंब और epifluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग झिल्ली वैश्विक intracellular कैल्शियम गतिशीलता के पास कैसे को मापने के लिए.

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Shigetomi, E., Khakh, B. S. Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes. J. Vis. Exp. (26), e1142, doi:10.3791/1142 (2009).

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Abstract

मस्तिष्क glial कोशिकाओं शामिल है. Astrocytes, glial सेल का एक प्रकार है, लंबे समय के लिए न्यूरॉन्स के लिए एक निष्क्रिय सहायक भूमिका प्रदान ज्ञात किया गया है है. हालांकि, बढ़ती सबूत से पता चलता है कि astrocytes को भी सक्रिय रूप से न्यूरॉन्स के साथ कार्यात्मक बातचीत के माध्यम से मस्तिष्क समारोह में भाग ले सकते हैं. हालांकि, astrocyte जीव विज्ञान के कई मौलिक पहलुओं विवादास्पद स्पष्ट नहीं है, और / या प्रयोगात्मक बेरोज़गार रहते हैं. एक महत्वपूर्ण मुद्दा astrocytes में intracellular कैल्शियम यात्रियों की गतिशीलता है. यह प्रासंगिक है क्योंकि कैल्शियम एक महत्वपूर्ण दूसरा दूत के रूप में अच्छी तरह से स्थापित है और क्योंकि यह प्रस्ताव किया गया है कि astrocyte कैल्शियम उन्नयन astrocytes से ट्रांसमीटरों की रिहाई को ट्रिगर कर सकते हैं. हालांकि, वहाँ के पास प्लाज्मा झिल्ली astrocytes में संकेत कैल्शियम के किसी भी विस्तृत या संतोषजनक वर्णन नहीं किया गया है. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली के बारे में 100 एनएम के भीतर physiologically प्रासंगिक संकेत घटनाओं का विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यहाँ, हम TIRF माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें और वर्णन कैसे प्लाज्मा झिल्ली और वैश्विक intracellular कैल्शियम की गतिशीलता के पास पर नजर रखने के लिए लगभग एक साथ. आगे शोधन और इस दृष्टिकोण के व्यवस्थित आवेदन astrocyte संकेत कैल्शियम की सटीक जानकारी के बारे में सूचित करने की क्षमता है. Astrocyte कैल्शियम की गतिशीलता का एक विस्तृत समझ एक आधार प्रदान करते हैं अगर, कैसे समझते हैं, कब और क्यों astrocytes और न्यूरॉन्स कैल्शियम पर निर्भर कार्यात्मक बातचीत से गुजरना सकता है.

Protocol

प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं

प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दो प्रमुख भागों है कि एक कदम बुद्धिमान तरीके से नीचे वर्णित हैं होते हैं.

भाग 1: तैयारी hippocampal astrocyte संस्कृतियों

संक्षेप में, मिश्रित hippocampal astrocyte न्यूरॉन संस्कृतियों एक अच्छी तरह से स्थापित 1,2,3 प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार किया गया . हम प्रक्रिया अनुकूलित करने के लिए स्वस्थ सभ्य astrocytes उपज. नीचे सूचीबद्ध सभी प्रक्रियाओं एक लामिना का प्रवाह हुड के रूप में एक बाँझ वातावरण में बाहर किया जाना चाहिए.

तैयारी coverslips

  • 22 मिमी coverslips (VWR, 48380-068)
  • पाली - डी (PDL, सिग्मा P0899) Lysine, aliquots (1 मिलीग्राम / एमएल)
  • Laminin (20 μg / एमएल) aliquots: 1 मिलीग्राम / एमएल laminin समाधान (L2020 सिग्मा) बाँझ पानी के 49 मिलीलीटर जोड़ने, -20 डिग्री सेल्सियस में 1.2 मिलीलीटर aliquots और दुकान
  1. बाँझ पानी में PDL भंग (50 μg / एमएल)
  2. Coverslips आटोक्लेव, बाँझ पानी और PDL में जगह (100 coverslips के लिए 20 मिलीलीटर) के साथ कुल्ला. कमरे के तापमान पर रातोंरात छोड़ो.
  3. PDL बाँझ पानी (3 व्यापक washes) के साथ बदलें. फिर coverslips दुकान और 4 डिग्री सेल्सियस सूखी
  4. एक बाँझ अच्छी तरह से में 6 अच्छी तरह से एक थाली पर (multiwell Lids के साथ फ्लैट नीचे बायोसाइंस BD से बाँझ, प्लेट्स) astrocytes, जगह व्यक्ति coverslips चढ़ाना दिन पहले. प्रत्येक coverslip पर laminin के 400 μl रखो और रातोंरात सेते हैं, इनक्यूबेटर में वाष्पीकरण से बचने के.

विच्छेदन

विच्छेदन मीडिया:

  • 500 मिलीलीटर है Earle संतुलित नमक (EBSS) समाधान (1X), तरल (Invitrogen, 14155-063)
  • 5 मिलीलीटर HEPES समाधान (सिग्मा, H0887)

Hippocampal मीडिया:

  • 412.5 मिलीलीटर न्यूनतम आवश्यक (सदस्य) मध्यम (1X), तरल है Earle लवण शामिल है, लेकिन कोई एल glutamine या phenol लाल (Invitrogen, 51200-038)
  • 10 मिलीलीटर (सिग्मा, डी (+) ग्लूकोज ANHYDROUS सिग्मा अल्ट्रा G7528) ग्लूकोज सदस्य एम 1
  • 5 मिलीलीटर पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen, 15140-122)
  • 5 मिलीलीटर सोडियम पाइरूवेट समाधान (सिग्मा, S8636)
  • 12.5 मिलीलीटर HEPES समाधान एम 1 (सिग्मा, H0887)
  • 5 मिलीलीटर N-2 (100X) अनुपूरक, तरल (Invitrogen, 17502-048)
  • 50 मिलीलीटर हार्स सीरम, हीट निष्क्रिय (Invitrogen, 26050-088)

Papain समाधान:

  • Worthington शीशी PAPAIN - 022 (LK003178, अंतिम एकाग्रता, 20 यू / एमएल) में विच्छेदन मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 37 पर सेते ° C 60 मिनट के लिए.

  1. चूहे पिल्ले आयु वर्ग के (आमतौर पर 2 पिल्ले) P1 पुनरीक्षित और राष्ट्रीय नियमों और अपने स्थानीय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित दिशा निर्देशों का पालन सिर काटना.
  2. पेट्री डिश में त्वचा और खोपड़ी और जगह मस्तिष्क ठंड विच्छेदन मीडिया के साथ भरा निकालें.
  3. Meninges हटाया, दोनों गोलार्द्धों काटना और hippocampi काटना.
  4. ~ 1x1 टुकड़े मिमी और papain समाधान में पचाने में 37 ° 11-13 मिनट के लिए सी में जल्द hippocampi.
  5. एक बार ऊतक के टुकड़े तय हो चुका है, सावधानी papain हटाने और hippocampal माध्यम से 5 मिलीलीटर जोड़ने के लिए एंजाइम के सभी निशान हटाने. इस कदम और hippocampal मध्यम (2 मिलीलीटर) में resuspend दोहराएँ.
  6. ~ कोशिकाओं Triturate 5 बार जब तक वहाँ कोई छोड़ दिया तीन उत्तरोत्तर छोटे तंग करती है (1000 सुक्ष्ममापी, ~ 500 सुक्ष्ममापी और ~ 300 सुक्ष्ममापी) की लौ पॉलिश pipettes साथ clumps, कर रहे हैं.
  7. एक बार triturated, एक सेल झरनी (ताकना आकार, 70 सुक्ष्ममापी, बायोसाइंस बी) के माध्यम से कोशिकाओं से गुजारें. निलंबन के 10 μl में कोशिकाओं को गिन लो. Hippocampal मध्यम मात्रा समायोजित करने में 400000 कोशिकाओं / एमएल.
  8. Coverslips बंद laminin Aspirate, और पहले कवर coverslip प्रति सेल निलंबन के शुष्क कर सकते हैं, प्लेट 200 μl.
  9. इनक्यूबेटर में 60 मिनट के लिए उन्हें संलग्न करने के लिए, और तब अच्छी तरह से प्रति hippocampal मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ने छोड़ो.
  10. अगले दिन, पुराने hippocampal मध्यम aspirate मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने और पूर्व गर्म ताजा hippocampal के माध्यम से 2 मिलीलीटर जोड़ने.

रखरखाव

Neurobasal मीडिया:

  • 500 मिलीलीटर neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
  • 10 मिलीलीटर B27 सीरम मुक्त पूरक (Invitrogen, 17504-044)
  • 5 मिलीलीटर पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen, 15140-122)
  • 1.25 एल glutamine मिलीलीटर (Invitrogen, 25030-149)

Neurobasal मध्यम के साथ फ़ीड astrocyte - न्यूरॉन एक सप्ताह में दो बार संस्कृतियों, चढ़ाना के चार दिन बाद शुरू. एक हवादार फ्लास्क में इनक्यूबेटर में 30 मिनट के बारे में मीडिया को Preincubate संतुलित तापमान और सीओ 2.

भाग 2: कैल्शियम इमेजिंग

Hippocampal रिकॉर्डिंग बफर: 110 मिमी NaCl, 5.4 मिमीKCl, 1.8 मिमी 2 CaCl, 0.8 मिमी 2 MgCl, 10 डी ग्लूकोज मिमी, 10 मिमी (सिग्मा से सभी रसायनों) 7.4 पीएच HEPES (NaOH के साथ समायोजित).

Astrocytes में कैल्शियम सूचक डाई लोड हो रहा है

  1. एक अच्छी तरह से में एक 6-2 मिलीलीटर hippocampal रिकॉर्डिंग DMSO में 2.5 सुक्ष्ममापी Fluo 4-AM (Invitrogen, एफ 14,217) और 0.05% Pluronic ® F-127% 20 समाधान युक्त बफर के साथ अच्छी तरह से भरा प्लेट पर संस्कृति (Invitrogen प्लेस, पी 3000MP) और 10-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  2. Fluo-4 समाधान निकालें और coverslips hippocampal रिकॉर्डिंग और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बफर सेते के साथ 3 बार धो लो.
  3. कक्ष पर coverslip प्लेस, और लेंस सफाई तरल के साथ coverslip के दूसरे पक्ष साफ.
  4. उद्देश्य पर विसर्जन के तेल के एक छोटे ड्रॉप (Cargille से विसर्जन तेल TYPE लोमो) रखो और चैम्बर (वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स से 25 मिमी दौर coverslip के लिए ओपन कक्ष) खुर्दबीन (IX71 ओलिंप) की अवस्था पर डाल दिया.
  5. संचरण प्रकाश का उपयोग देखने के लिए कैसे कोशिकाओं को देखो, और उन्हें ध्यान में कोशिकाओं को देखो. फिर एक monochromator से 488 एनएम के साथ कोशिकाओं (विचित्र वी विजन तक से) रोशन और निर्धारित अगर Fluo-4 के प्रतिदीप्ति संकेत वर्दी और astrocytes में detectable है.
  6. Astrocytes में कैल्शियम उपाय महामारी TIRF और रोशनी का उपयोग करें.

TIRF माइक्रोस्कोपी

संक्षेप में, हम एक ओलिंप IX71 एक Andor iXon DV887DCS EMCCD कैमरे के साथ सुसज्जित खुर्दबीन का उपयोग करें. उत्तेजना के नियंत्रण और छवि के अधिग्रहण TILLVision सॉफ्टवेयर का प्रयोग कर प्राप्त किया है. 454/488/515 एनएम (100 मेगावाट) आर्गन और 442 एनएम ठोस राज्य पराबैंगनीकिरण (45 मेगावाट) के मुस्कराते हुए और संयुक्त के साथ नियंत्रित कर रहे हैं एक तक पॉलीलाइन लेजर combiner, TIRF दोहरी बंदरगाह संघनित्र और acoustoptical tuneable फिल्टर और नियंत्रक (AOTF, सब से तक) फोटोनिक्स और Kineflex TIRF कंडेनसर में प्रवेश के लिए ब्रॉड बैंड फाइबर में खिलाया. हम एक ओलिंप 60x 1.45 एनए लेंस का उपयोग करने के लिए TIRF प्राप्त करने. कैमरा लाभ प्रत्येक astrocyte के लिए निकाला जाता है शोर छवियों के लिए सबसे अच्छा संकेत प्रदान करते हैं. पृष्ठभूमि और TIRF माइक्रोस्कोपी के सिद्धांतों हाल ही में किया गया है 4 समीक्षा 5 ,. अधिकांश ऑप्टिकल घटकों का उपयोग हम फोटोनिक्स, जो अब Agilent टेक्नोलॉजीज (http://www.till-photonics.com/) का हिस्सा है तक से खरीदे गए थे. TIR प्रवेश गहराई नीचे समीकरणों से गणना की जा सकती है.

समीकरण

घ = प्रवेश गहराई

कांच के n1 = अपवर्तक सूचकांक

सेल के n2 = अपवर्तक सूचकांक

घटना के एक = कोण

घटना के Nai = संख्यात्मक एपर्चर


आदेश में यह सुनिश्चित करने के लिए लेजर बेहतर TIRF के लिए गठबंधन किया है हम यह 100 एनएम फ्लोरोसेंट मनका (Invitrogen, F8803) निरीक्षण के लिए उपयोगी पाते हैं. हम अभी भी फ्रेम और महामारी और TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ मोती के वीडियो प्रस्तुत करते हैं. जब TIRF में, एक संकेत करने वाली शोर में एक नाटकीय वृद्धि देखने और मोती ब्राउनियन प्रसार प्रदर्शन. हम यह लगता है कि इष्टतम TIRF बजाय समझौता परोक्ष रोशनी है कि घटित होता है तब होती है, के लिए एक नियमित रूप से (एक बार ~ प्रति सप्ताह) के आधार पर TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ 100 एनएम मोतियों के व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए उपयोगी पाते हैं अगर महत्वपूर्ण कोण के बराबर नहीं थे α (चित्र 1 देखें).

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर agonists के आवेदन

Astrocytes GQ युग्मित रिसेप्टर्स 6, 7 के metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स और P2Y रिसेप्टर्स (agonist, एटीपी, ADP) सहित कई प्रकार व्यक्त करते हैं. इन रिसेप्टर्स की सक्रियण astrocytes भीतर intracellular कैल्शियम का स्तर में उल्लेखनीय वृद्धि की ओर जाता है है. उदाहरण के लिए, एक astrocytes 8-10 एटीपी (30 सुक्ष्ममापी) के लिए आवेदन के दौरान आसानी से intracellular कैल्शियम उन्नयन का पालन कर सकते हैं. हम एक तेजी से समाधान वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स से switcher के कुलपति 77SP परफ्यूज़न फास्ट कदम प्रणाली (http://www.warneronline.com/index.cfm) कहा जाता है का उपयोग करें. के साथ इस पद्धति का समाधान ~ 10 एमएस की तुलना में भी कम समय में लागू किया जा सकता है.

चित्रा 1





चित्रा 1 कार्टून और इमेजिंग की तस्वीरें सेट. ए एक airtable पर घुड़सवार माइक्रोस्कोप की एक तस्वीर दिखाता है, जबकि (बी) लेजर विधानसभा, नियंत्रकों और बीम बक्से की एक तस्वीर दिखाता है. सी. इमेजिंग के लिए घुड़सवार चैम्बर के साथ खुर्दबीन मंच की एक तस्वीर दिखाता है. पर छोड़ दिया है तेजी से छिड़काव डिवाइस (साथ stepper मोटर और थीटा टयूबिंग के साथ) देखा जा सकता है. सही में एक Axopatch 200A प्रवर्धक के headstage देखा जाता है. कार्टून सेट में पथ schematizes प्रकाश और टी कैसेIRF हासिल है. लेजर वापस 60x एनए 1.45 उद्देश्य लेंस और अपनी स्थिति के फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित है केंद्र बंद समायोजित इतना है कि यह महत्वपूर्ण कोण α पर विसर्जन तेल में उभर. इस बिंदु पर किरण दूरी λ (मुख्य पाठ में समीकरण देखें) के साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब और decays से कम अपवर्तक सूचकांक के माध्यम में ग्रस्त है. इस मामले में इस रिकॉर्डिंग astrocytes और खुद astrocytes आसपास बफर है. परिणाम ~ 100 एनएम प्लाज्मा झिल्ली के भीतर अणुओं के ऑप्टिकल उत्तेजना (और इस तरह इमेजिंग) है. सेल के कार्टून में यह हरी "उत्साहित" झिल्ली रिसेप्टर्स के रूप में दिखाया गया है, जबकि कक्ष के भीतर या सेल के ऊपर की सतह पर उन उत्साहित नहीं हैं. TIRF माइक्रोस्कोपी की एक पूर्ण खाता Steyer और Almers 4 द्वारा प्रदान की गई है.

चित्रा 2

चित्रा 2 100 एनएम फ्लोरोसेंट महामारी और TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहीत मोतियों की छवियाँ . कई दर्जन 100 एनएम फ्लोरोसेंट मोती के साथ देखने के क्षेत्र की महामारी छवियों को दिखाता है. लाल तीर मोती है कि गिलास coverslip पर बसे है, जबकि नीले arrowheads मोती है कि पानी में diffusing के बिंदु को इंगित करें. बी देखने का एक ही क्षेत्र के रूप में इस दृश्य में ए में दिखाया केवल अनुयायी मोती लाल तीर द्वारा दिखाया दिखाई दे रहे हैं TIRF छवि दिखाता है. यह है क्योंकि इन कांच coverlsip पर बसे थे और इस प्रकार ~ 100 एनएम क्षणभंगुर क्षेत्र के भीतर थे. नीले तीर द्वारा दिखाया गया मोतियों और इस क्षेत्र के भीतर नहीं हैं TIRF छवियों में इस तरह अदृश्य हैं. कम भूखंडों छवियों के 3 डी प्रतिपादन दिखा. यह स्पष्ट है कि क्षणभंगुर क्षेत्र के भीतर माला के लिए संकेत करने वाली शोर में एक बड़ी वृद्धि तब होता है जब TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया. वास्तव में महामारी के लिए इन छवियों के लिए संकेत करने वाली शोर 7.1 ± 0.6 था, जबकि TIRF के लिए यह 20 था ± 0.7.

चित्रा 3

चित्रा 3 Fluo-4 कैल्शियम सूचक महामारी और TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ अधिग्रहीत डाई के साथ भरी हुई astrocytes की छवियाँ . पांच astrocytes के साथ देखने के एक क्षेत्र के ए महामारी छवियाँ. बी बी नोट है कि में छवियों ए और बी काफी अलग हैं में दिखाया गया है देखने के एक ही क्षेत्र के एक TIRF छवि. यह है क्योंकि TIRF रोशनी के साथ कांच coverslip के करीब समानाधिकरण में केवल प्लाज्मा झिल्ली क्षेत्रों imaged हैं. कम पैनल दिखाने एटीपी पैदा intracellular कैल्शियम यात्रियों महामारी और TIRF माइक्रोस्कोपी के साथ imaged.

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Discussion

यह अच्छी तरह से स्थापित है कि astrocytes intracellular कैल्शियम उन्नयन प्रदर्शन. ये सहज होते हैं, neuronal गतिविधि के द्वारा या agonists के आवेदन astrocyte 11 सतह पर रिसेप्टर्स सक्रिय द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है. एक महत्वपूर्ण और विवादास्पद मुद्दा है कि क्या astrocyte intracellular कैल्शियम उन्नयन संकेतन अणुओं में से एक यह है कि न्यूरॉन्स 11, 12 पर रिसेप्टर्स सक्रिय रिहाई को ट्रिगर कर सकते हैं. यह विवादास्पद है क्योंकि वहाँ इस दृश्य के लिए और के खिलाफ सबूत है, के रूप में Haydon 7, 13 और McCarthy के 11 प्रयोगशालाओं द्वारा समीक्षा में प्रकाश डाला गया है. हमारे हाल ही मस्तिष्क टुकड़ा इमेजिंग और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा हम तर्क दिया है कि astrocyte कैल्शियम की गतिशीलता का एक बेहतर और सटीक समझ पहले नई परिकल्पना संचालित प्रयोगों के लिए निर्धारित astrocytes प्रभाव कैसे न्यूरॉन्स 14 बनाया जा सकता है है की जरूरत है के आधार पर. इस वीडियो लेख में हम प्लाज्मा झिल्ली और वैश्विक सभ्य astrocytes में intracellular कैल्शियम लगभग एक साथ परिवर्तन के पास छवि के लिए एक सरल तरीका मौजूद है. TIRF माइक्रोस्कोपी का एक अपरिहार्य तकनीकी आवश्यकता है कि संवर्धित कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा है, क्योंकि वे क्षणभंगुर क्षेत्र 3 गहराई के भीतर एक गिलास coverslip के लिए पालन . यह कि संस्कृति में astrocytes उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल बदल जब 15 vivo में उन लोगों की तुलना में, और इसलिए इस चेतावनी जब इस पद्धति को लागू करने पर विचार किया जाना चाहिए टिप्पण लायक है. लेकिन मन में इस विचार के साथ सरल विधि हम रिपोर्ट एक छवि की अनुमति नहीं है और प्लाज्मा झिल्ली और वैश्विक intracellular कैल्शियम परिवर्तन के पास लगभग एक साथ यों. दृष्टिकोण के आगे astrocytes के लिए आवेदन astrocytes के प्लाज्मा झिल्ली के पास intracellular कैल्शियम परिवर्तन पर सटीक डाटा उपलब्ध कराने का वादा रखती है. ऐसे मात्रात्मक डेटा की उपलब्धता astrocyte जीव विज्ञान की पूरी समझ के लिए उपयोगी हो जाएगा.

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Acknowledgements

यह काम जापान के Uehara मेमोरियल फाउंडेशन (ते के लिए) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से व्हाइटहॉल फाउंडेशन, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ स्नायविक विकारों और स्ट्रोक और एक स्टीन ओप्पेन्हेइमेर बंदोबस्ती पुरस्कार (BSK के लिए) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
VWR® Micro Cover Slips, Round, No. 1 Tool VWR international 48380-068
Poly-D-lysine hydrobromide Reagent Sigma-Aldrich P0899
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane Reagent Sigma-Aldrich L2020
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) (1X), liquid Reagent Invitrogen 14155-063
Minimum Essential Medium (MEM) (1X), liquid Contains Earle’s salts, but no L-glutamine or phenol red Reagent Invitrogen 51200-038
Penicillin-Streptomycin liquid Reagent Invitrogen 15140-122
Sodium pyruvate solution Reagent Sigma-Aldrich S8636
HEPES solution 1 M Reagent Sigma-Aldrich H0887
N-2 Supplement (100X), liquid Reagent Invitrogen 17502-048
Horse Serum, Heat-Inactivated Reagent Invitrogen 26050-088
PAPAIN-022 Reagent Worthington Biochemical LK003178
Neurobasal™ Medium (1X) Liquid without Phenol Red Reagent Invitrogen 12348-017
B-27 Serum-Free Supplement (50X), liquid Reagent Invitrogen 17504-044
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid Reagent Invitrogen 25030-149
Cell Strainers Tool BD Biosciences 352350
BD Falcon Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, Sterile Tool BD Biosciences 353046
NaCl Reagent Sigma-Aldrich S7653
KCl Reagent Sigma-Aldrich P3911
CaCl2 hexahydrate Reagent Sigma-Aldrich 21108
MgCl2 hexahydrate Reagent Sigma-Aldrich M2670
HEPES free acid Reagent Sigma-Aldrich H3375
D-(+)-glucose Reagent Sigma-Aldrich G7528
Fluo-4, AM 1 mM solution in DMSO Reagent Invitrogen F-14217
Pluronic® F-127 20% solution in DMSO Reagent Invitrogen P-3000MP
Immersion Oil TYPE DF Microscope Cargill Labs 16242
Open chamber for 25 mm round coverslips, 100 μl volume Tool Warner Instruments 64-0362 (RC-21BDW)
P-2 platform for Series 20 chambers, non-heater Tool Warner Instruments 64-0278 (P-2)
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) 2% solids Reagent Invitrogen F8803

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References

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