प्राथमिक संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स में घने कोर vesicles के लाइव इमेजिंग

Biology

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ERRATUM NOTICE

Summary

लाइव सेल इमेजिंग विशेष उपयोगिता है जब organelle तस्करी की गतिशीलता का अध्ययन. यहाँ हम व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग सभ्य न्यूरॉन्स में घने कोर vesicles के रहते इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल लचीला है और ऐसे mitochondria के रूप में में छवि अन्य organelles के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, endosomes, और peroxisomes.

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Kwinter, D. M., Silverman, M. A. Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (27), e1144, doi:10.3791/1144 (2009).

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Abstract

Protocol

भाग 1: 2000 Lipofectamine (Invitrogen) का उपयोग न्यूरॉन्स के अभिकर्मक

सेट - अप उपकरण:

चूहा या माउस hippocampal न्यूरॉन्स Kaech और बैंकर, 2006 के अनुसार सुसंस्कृत हैं. [4] ठेठ सेल transfections के लिए इस्तेमाल किया घनत्व 250,000 cells/6-cm पकवान है. आवश्यक अभिकर्मकों और उपकरण में 50 मिमी kynurenic एसिड, नियमित benchtop ट्यूब धारक, एक benchtop कूलर (सबसे अच्छा Lipofectamine अभिकर्मक ठंडा रखने के लिए) शामिल हैं,
Lipofectamine अभिकर्मक, सदस्य, microfuge ट्यूबों, micropipetters, और बाँझ संदंश.

प्रक्रिया:

  1. प्रत्येक अभिकर्मक लेबल के लिए दो 1.5 एमएल ट्यूबों, प्लास्मिड डीएनए, एक अभिकर्मक अभिकर्मक शामिल होते हैं. निम्नलिखित incubations कमरे के तापमान पर आगे बढ़ सकते हैं.
    1. प्लास्मिड डीएनए के एक ट्यूब में 100 μL सदस्य के साथ 1.0 μg कम्बाइन (किसी भी प्रकार के पूरक के बिना, सदस्य equilibrated पीएच के तापमान की जरूरत नहीं है).
    2. 6.0 अन्य 1.5 एमएल ट्यूब में 100 μL सदस्य के साथ μL Lipofectamine कम्बाइन.
      1. डबल transfections के लिए कोई समायोजन आवश्यक हैं भले ही Lipofectamine: डीएनए अनुपात ऐसे मामलों में आधा हो जाएगा. Lipofectamine: डीएनए का अनुपात अभी भी निर्माता के सुझाव के भीतर है. यह सबसे अच्छा है एक प्लाज्मिड के लिए इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए 0.5-1.0 μg परीक्षण.
      2. Lipofectamine अभिकर्मक के शेल्फ जीवन की रक्षा करने के लिए, यह संभव के रूप में के रूप में कम समय के लिए रेफ्रिजरेटर से हटा दिया जाना चाहिए और एक benchtop कूलर में रखा जब उपयोग में नहीं है.
        रेफ्रिजरेटर से बाहर कुल समय एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए.
  2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को सेते हैं.
  3. लिपिड ट्यूब में डीएनए में सदस्य समाधान स्थानांतरण, और धीरे विंदुक के साथ मिश्रण, तो कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. 25 मिनट के बाद, flipping के coverslips पहले, 50 मिमी kynurenic एसिड के 60 μL जोड़ने excitoxic सभ्य न्यूरॉन्स के पकवान नुकसान को कम.
    1. ध्यान फ्लिप coverslips पैर साइड बाँझ संदंश का उपयोग कर, और व्यवस्था है ताकि वे ओवरलैप नहीं है. Coverslip के न्यूरॉन लेपित सतह या पकवान की glia लेपित सतह नहीं परिमार्जन करने के लिए सावधान रहें.
  5. माध्यम की 0.5 एमएल लगभग 6 सेमी पकवान से ले लो और धीरे से ट्यूब में डीएनए के साथ मिश्रण करने के लिए, डीएनए समाधान वापस हस्तांतरण माध्यम की सतह पर समान रूप से टपकता पकवान.
  6. ज़ुल्फ़ नहीं, लेकिन धीरे पकवान एक दिशा में आगे और पीछे स्लाइड करो, तो बंद करो और सीधा दिशा में दोहराने के लिए समान रूप से वितरित डीएनए Lipofectamine परिसरों है. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 ° सी, 5% सीओ 2) में 90 मिनट के लिए सेते हैं .
  7. फ्लिप coverslips पैर नीचे की ओर, और व्यवस्था है ताकि वे ओवरलैप नहीं है. अभिव्यक्ति वांछित समय के लिए आगे बढ़ने के लिए, आमतौर पर 48 घंटे के लिए रातोंरात की अनुमति दें.

भाग 2: GFP टैग सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स में घने कोर vesicles के लाइव इमेजिंग

सेट - अप उपकरण:

  1. जीवित कोशिकाओं की इमेजिंग एक प्रतिदीप्ति एक सीसीडी कैमरे के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है, हम एक Leica DMI 6000B उल्टे खुर्दबीन Leica चर, फ्लोरोसेंट लैंप के साथ सुसज्जित का उपयोग करें. इसके अलावा तापमान नियंत्रक और एक उद्देश्य हीटर के साथ एक इमेजिंग चैम्बर की आवश्यकता है. हम का उपयोग करें वार्नर उपकरण RC-21BR एक मंच हीटर के अलावा में एक 18 मिमी coverslip के लिए संशोधित (# cat. PH2) और तापमान नियंत्रक (# cat. TC324B). कक्ष नहीं खुला बंदरगाहों, एक संशोधन है कि जब कक्ष आदेश शामिल किया जा सकता शामिल हैं. एक उद्देश्य हीटर उच्च coverslip का तापमान बनाए रखने और तापमान के उतार चढ़ाव की वजह से ध्यान केंद्रित में परिवर्तन को कम करने में मदद के लिए सिफारिश की है. छवियाँ एक Orca ईआर हमामात्सू अधिग्रहण के 'स्ट्रीमिंग' मोड ड्रॉप में सहित Metamorph सॉफ्टवेयर (आण्विक डिवाइसेज) का उपयोग कर के साथ प्राप्त कर रहे हैं. नोट - हम एक जलवायु चैम्बर है कि पूरे खुर्दबीन encloses प्रयोग नहीं करते. इस के अलावा महंगी और अल्पकालिक यहाँ वर्णित इमेजिंग के लिए आवश्यक नहीं है.
  2. अन्य उपकरणों और अभिकर्मकों हौसले से तैयार रहते इमेजिंग (2 Ca के साथ 1X + मिलीग्राम और 2 +, 0.6% ग्लूकोज हैंक्स, और 10mm HEPES) मध्यम, अतिरिक्त 18 मिमी कांच coverslips, बाँझ संदंश, गैर बाँझ संदंश, Kimwipes, वैक्यूम तेल शामिल , और (सुई के बिना, या व्यापक बोर संशोधित सुई के साथ) सिरिंज के साथ जो तेल लागू करने के लिए.

प्रक्रिया:

  1. ताजा रहते इमेजिंग मध्यम तैयार (2 Ca के साथ 1X + मिलीग्राम और 2 +, 0.6% ग्लूकोज हैंक्स, और 10mm HEPES). हम आम तौर पर एक बार और दुकान पर 50mls 4 ओ सी में जब उपयोग में नहीं तैयार. यह सबसे अच्छा है पर्याप्त से अधिक नहीं एक सप्ताह के लिए एक समय में तैयार. लगभग 5-10 एमएल न्यूरॉन्स के पकवान प्रति किया जाता है.
  2. माइक्रोस्कोप, कैमरा, फ्लोरोसेंट लैंप, और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शुरू करो. इसके अलावा सत्ता पर चैम्बर मंच और उद्देश्य heaters के लिए बारी है.
  3. कल्पना की तैयारीछ कक्ष.
    1. वार्नर कक्ष coverslips के बढ़ते के लिए एक Teflon डालने शामिल है. हेरफेर "ऊपर" एक स्थायी मार्कर के साथ डालने के लेबल एक पक्ष की आसानी के लिए.
    2. "शीर्ष" लेबल कक्ष के पक्ष में छेद के आसपास नाली के लिए तेल की एक अंगूठी लागू करें. अधिक का उपयोग कर के रूप में यह कक्ष में प्रवेश और नमूदार क्षेत्र कम हो जाएगा से बचें.
    3. संदंश का प्रयोग, कक्ष के "शीर्ष" पक्ष के लिए एक स्वच्छ, अप्रयुक्त coverslip 18 सेमी देते हैं, अपने किनारों पर coverslip कोमल दबाव चैम्बर के recessed नाली के भीतर एक तंग सील बनाने लागू.
    4. चैम्बर मुड़ें और नाली कक्ष (नीचे) के विपरीत पक्ष पर तेल की एक इसी तरह की अंगूठी लागू.
    5. 50 एमएल, एक ट्यूब जो एक आदर्श कक्ष धारक के ढक्कन पर तैयार चैम्बर नीचे की ओर रखें.
    6. चैम्बर इमेजिंग के माध्यम से 750 μL जोड़ें. यह एक अत्यधिक राशि है, लेकिन तेल पर spilling से मध्यम रोकने के लिए और अधिक से किया जा रहा फंस जब सेल कवर coverslip लागू किया जाता है बुलबुले को रोकने में मदद मिलेगी चाहिए.
    7. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में तैयार कक्ष बनाए रखें जब तक की जरूरत है. लम्बे समय तक incubations ~ 1 घंटे के रूप में इमेजिंग के माध्यम से लुप्त हो जाना और संरचना में बदल जाएगा से बचा जाना चाहिए.
  4. अंतिम कक्ष विधानसभा और जीना सेल इमेजिंग प्रदर्शन.
    1. टिशू कल्चर हुड के लिए तैयार और इनक्यूबेटर से ट्रांसफ़ेक्ट coverslips का एक पकवान कक्ष ले जाएँ.
    2. अंतिम कक्ष विधानसभा जल्दी से किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कोशिकाओं मध्यम और 37 डिग्री सेल्सियस लगातार डूबे रहते हैं.
    3. बाँझ संदंश का प्रयोग, ध्यान ट्रांसफ़ेक्ट पकवान से एक coverslip निकालने के लिए, एक Kimwipe coverslip के किनारे छूने के लिए दूर मध्यम विकास आकर्षित.
    4. Coverslip तैयार कक्ष पर न्यूरॉन साइड नीचे रखें. तेल coverslip के एक पक्ष पहली बार टच और किनारों के आसपास दबाव लागू फँसाने बुलबुले के बिना फ्लैट coverslip लाने. अतिरिक्त इमेजिंग मध्यम बाहर फैल के रूप में की उम्मीद करेंगे.
    5. से अतिरिक्त इमेजिंग मध्यम पोछो, लेकिन स्थिति से बाहर coverslips स्लाइड नहीं सावधान रहना.
    6. पूर्व गर्म हीटर मंच कक्ष ले जाएँ और जगह में चैम्बर जकड़ना.
    7. मंच पर चैम्बर स्थानांतरण.
    8. Photobleaching और photoxicity कम तीव्रता ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को खोजने के लिए आवश्यक की न्यूनतम राशि के लिए दीपक समायोजित करें.
    9. एक कम बढ़ाई तेल उद्देश्य (40x) के साथ ब्याज की एक सेल का पता लगाएं. यह फायदेमंद है एक योजना बनाई खोज पैटर्न के लिए छड़ी के लिए अधिक से अधिक coverslip कवरेज सुनिश्चित करने के लिए और बेमानी छवि अधिग्रहण, उदाहरण के लिए, coverslip के ऊपरी बाएँ, ऊपर स्कैनिंग और नीचे सही करने के लिए काम कर से बचने के.
    10. एक उच्च बढ़ाई तेल उद्देश्य (60 100x) करने के लिए स्विच एक बार एक वांछित क्षेत्र में स्थित किया गया है.
    11. "धारा" अधिग्रहण या आपके इमेजिंग सॉफ्टवेयर के तुलनीय समारोह का उपयोग fluorescently लेबल प्रोटीन की गतिशीलता का एक वीडियो रिकॉर्ड करने के लिए.
    12. एक चरण और बाद में विश्लेषण और प्रस्तुति के लिए छवि किसी अन्य के साथ छवियों (जैसे घुलनशील GFP) ले लो.
    13. Coverslip आगे की खोज और अगले वीडियो रिकॉर्डिंग से पहले सभी छवियों को बचाओ.
    14. आमतौर पर एक coverslip से 3-5 वीडियो सफल माना जाता है. Phototoxicity और सामान्य सेल के स्वास्थ्य को ध्यान में रखा जाना चाहिए के रूप में परिवहन क्षतिग्रस्त कोशिकाओं में कम है. सेल स्वास्थ्य चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग अवलोकन द्वारा नजर रखी जा सकती है. आमतौर पर रिकॉर्डिंग coverslip प्रति लगभग 30 मिनट के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं.

भाग 3: प्रतिनिधि परिणाम:

लाइव सेल इमेजिंग टिप्पणियों को आम तौर पर वीडियो (भी छवियों के ढेर "के रूप में जाना जाता है) है कि दृश्य (चित्र 1 ए) के क्षेत्र के भीतर fluorescently टैग organelles के आंदोलन दिखाने से मिलकर बनता है. प्रत्येक वीडियो उनके साथ अक्सर छवियों है कि प्रोटीन अभिव्यक्ति और / या सेल के स्वास्थ्य के सेल शरीर के स्तर पर, सम्मान के साथ देखने के क्षेत्र के उन्मुखीकरण वर्णन का समर्थन कर रहे हैं. परिवर्तन द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए परिवहन के वीडियो kymographs (चित्रा 1 बी) के अधीन किया जा सकता है. Kymographs छवियों है कि जहां हर बार बिंदु kymograph में एक स्तंभ के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है लाइन स्कैन juxtaposing द्वारा कण आंदोलन वर्णन कर रहे हैं. चित्रा 2 दर्शाता है कि कैसे दो विपरीत दिशा में जा कणों kymograph में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. Kymographs के आगे विश्लेषण कण प्रवाह, वेग, रन लंबाई, reversals, और स्थिर कणों के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं.


चित्रा 1 प्रतिनिधि लाइव सेल इमेजिंग टिप्पणियों (ए) mCherry टैग ऊतक plasminogen (टीपीए) उत्प्रेरक परिवहन के एक वीडियो से चयनित फ्रेम. व्यक्तिगत कणों अग्रगामी में जाने (हरी तीर) और (लाल तीर) प्रतिगामी दिशाओं संकेत कर रहे हैं. (बी) illustrating Kymographs में आंदोलन टीपीए mCherryअक्षतंतु. Kymographs में क्षैतिज लाइनों स्थिर वस्तुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि विकर्ण लाइनों organelles (सकारात्मक ढलान) या (नकारात्मक ढलान) के ओर से सेल शरीर के दूर जाने का प्रतिनिधित्व करते हैं. लंबे हरे और लाल तीर चलता है (ए) में कणों के लिए इसी चलाता है. परिवहन में परिवर्तन के कारण microtubule depolymerizing अभिकर्मक, nocodazole, भी एक kymograph के साथ सचित्र है. विकर्ण लाइनों के अभाव से चलती organelles में कमी नोट.

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Discussion

लाइव सेल इमेजिंग organelle सभ्य न्यूरॉन्स में परिवहन के प्रत्यक्ष प्रेक्षण के लिए एक चुनौती है, लेकिन शक्तिशाली तकनीक है. कठिनाइयाँ अपस्ट्रीम गरीब न्यूरॉन संस्कृति जटिलताओं की वजह से स्वास्थ्य के साथ प्रक्रिया के उत्पन्न कर सकते हैं. इसलिए, देख coverslips जबकि मध्यम विकास में एक टिशू कल्चर प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सेल स्वास्थ्य (उदाहरण के लिए रेफरी देखने के 4.) पहले और बाद अभिकर्मक मूल्यांकन किया जाना चाहिए. हस्तांतरण की प्रक्रिया न्यूरॉन युक्त इमेजिंग चैम्बर coverslips कोशिकाओं के लिए तनावपूर्ण हो सकता है, इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है जब coverslips छेड़खानी करने के लिए देखभाल व्यायाम कर सकते हैं. यह आम के लिए स्वस्थ कोशिकाओं को दिखाने के लिए कोई प्रक्रिया में देरी, या उपकरण या इमेजिंग मीडिया के संतुलन की अधूरी पूर्व हीटिंग की वजह से परिवहन कर सकते हैं. परिवहन विश्लेषण के लिए axonal और वृक्ष के समान उन्मुखीकरण ज्ञात होना चाहिए, अग्रगामी और प्रतिगामी परिवहन भेद अर्थात्. इसलिए यह यकीन है कि एक सेल शरीर के स्थान निर्धारित किया है और एक सतत neuronal खंड सेल शरीर के लिए ब्याज के क्षेत्र को जोड़ने देखा जा सकता है है कि महत्वपूर्ण है. अक्सर घुलनशील GFP की छवियों अतिव्यापी बचत, या informatively बचाया वीडियो फ़ाइल नामकरण, विश्लेषण के लिए 'प्रक्रियाओं ओरिएंटेशन, जैसे, "Cell1CellBodyUpperLeft" का पता लगाने के लिए पर्याप्त है.

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Acknowledgments

हम उनके इस पांडुलिपि के सावधान पढ़ने के लिए Harald Hutter और हेलेना डेकर धन्यवाद. हम भी अपनी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए Leica माइक्रोसिस्टम्स से रेग सिद्धू धन्यवाद. इस शोध राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद, कनाडा के 327100-06 # पुरस्कार, और साइमन फ्रेजर विश्वविद्यालय विज्ञान के संकाय द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine Reagent Mediatech, Inc. 10-010-CV
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-027 Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ Reagent GIBCO, by Life Technologies 14185-052 Live-imaging medium
1M HEPES Reagent GIBCO, by Life Technologies 15630-130 Live-imaging medium

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References

  1. Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (29), 10011-10016 (2008).
  2. Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49, (6), 797-804 (2006).
  3. Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19, (1), 274-283 (2008).
  4. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, (5), 2406-2415 (2006).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 01/20/2010. Citeable Link.

A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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