Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l'hippocampe

Biology

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ERRATUM NOTICE

Summary

Imagerie des cellules vivantes est d'une utilité particulière lorsque l'on étudie la dynamique du trafic des organelles. Nous décrivons ici un protocole d'imagerie en temps réel du noyau dense vésicules dans des neurones cultivés en utilisant la microscopie à fluorescence à champ large. Ce protocole est flexible et peut être adaptée aux organites autre image tels que les mitochondries, les endosomes, et les peroxysomes.

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Kwinter, D. M., Silverman, M. A. Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (27), e1144, doi:10.3791/1144 (2009).

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Abstract

L'observation et la caractérisation dynamique des processus cellulaires peuvent donner des informations importantes sur l'activité cellulaire qui ne peut pas être acquise à partir d'images statiques. Vital sondes fluorescentes, en particulier la protéine fluorescente verte (GFP) ont révolutionné la biologie cellulaire provenant de la capacité d'étiquette spécifique compartiments intracellulaires et des structures cellulaires. Par exemple, l'imagerie en temps réel de la GFP (et ses variantes spectrale) chimères ont permis une analyse dynamique du cytosquelette, le transport des organites, et la dynamique des membranes dans une multitude d'organismes et de types cellulaires [1-3]. Bien que l'imagerie vivons est devenue prédominante, cette approche pose encore de nombreux défis techniques, en particulier dans les neurones primaires en culture. Une des difficultés est l'expression de la GFP dans les protéines étiquetées neurones post-mitotiques, l'autre est la capacité à capturer des images fluorescentes tout en minimisant la phototoxicité, photoblanchiment, et maintenir la santé cellulaire en général. Ici nous fournissons un protocole qui décrit une méthode de transfection à base de lipides qui donne un taux de transfection est relativement faible (~ 0,5%), est cependant idéal pour l'imagerie des neurones complètement polarisée. Un taux faible de transfection est essentielle pour que les axones et des dendrites seule peut être caractérisée comme à leur orientation vers le corps cellulaire pour confirmer la directionnalité du transport, c'est à dire, antérograde c. rétrograde. Notre approche à l'imagerie neurones exprimant la GFP s'appuie sur une norme large champ microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD, un logiciel de capture d'image, et une chambre chauffée imagerie. Nous avons imagé une grande variété d'organites ou structures, par exemple, à noyau dense de vésicules, les mitochondries des cônes de croissance, et l'actine sans optiques ou exigences particulières d'excitation autre qu'une source de lumière fluorescente. De plus, le spectre est distincte, les protéines marquées par fluorescence, par exemple, la GFP et DsRed-protéines étiquetées, peuvent être visualisées simultanément près de caractériser la co-transport ou autres coordonnées événements cellulaires. L'approche d'imagerie décrit ici est flexible pour une variété d'applications d'imagerie et peut être adopté par un laboratoire pour un coût relativement peu fourni un microscope est disponible.

Protocol

Partie 1: La transfection de neurones utilisant Lipofectamine 2000 (Invitrogen)

Matériel mis en place:

Neurones hippocampiques de rat ou la souris sont cultivées selon les Kaech et Banker, 2006 [4]. La densité cellulaire typique utilisée pour la transfection est de 250.000 plat cells/6-cm. Réactifs nécessaires et les équipements comprennent 50 mM d'acide kynurénique, régulier porte-tube de paillasse, un refroidisseur de paillasse (le meilleur pour garder froids réactif Lipofectamine),
Réactif Lipofectamine, MEM, microtubes de, micropipetters, et une pince stérile.

Procédure:

  1. Pour chaque étiquette de transfection deux tubes de 1,5 ml, l'une pour contenir l'ADN plasmidique, une pour contenir le réactif de transfection. Les incubations suivantes peuvent procéder à la température ambiante.
    1. Combinez 1,0 ug d'ADN plasmidique avec 100 uL MEM dans un tube (sans suppléments de toute nature; MEM n'a pas besoin d'être à la température du pH équilibré).
    2. Combinez 6,0 uL Lipofectamine avec 100 uL MEM dans l'autre tube de 1,5 ml.
      1. Aucun ajustement pour les transfections doubles sont nécessaires même si la Lipofectamine: ratio de l'ADN va être réduite de moitié dans de tels cas. Le ratio de Lipofectamine: l'ADN est encore au sein de la suggestion du fabricant. Il est préférable de tester 0,5 à 1,0 pg pour chaque plasmide d'expression optimale.
      2. Pour préserver la durée de conservation du réactif Lipofectamine, il devrait être retiré du réfrigérateur pour une durée aussi courte que possible et placés dans une glacière paillasse lorsqu'il n'est pas utilisé.
        Durée totale du réfrigérateur doit être maintenu au minimum.
  2. Incuber les tubes pendant 5 minutes à température ambiante.
  3. Transférer la solution d'ADN-en-MEM dans le tube de lipides, et mélanger délicatement avec une pipette, puis incuber pendant 30 minutes à température ambiante.
  4. Après 25 minutes, avant de lamelles retournement, ajouter 60 ul de 50 mM d'acide kynurénique pour minimiser les dommages excitoxic le plat de neurones en culture.
    1. Lamelles soigneusement retourner pieds-secondaires à l'aide des pinces stériles, et d'organiser de sorte qu'ils ne se chevauchent pas. Soyez prudent de ne pas racler la surface des neurones à revêtement de la lamelle ou la surface glie revêtement du plat.
  5. Prenez environ 0,5 mL de milieu de l'antenne de 6 cm et mélanger délicatement avec de l'ADN dans le tube, le transfert de la solution d'ADN de retour à l'antenne goutte uniformément sur la surface du milieu.
  6. Ne pas tourbillon, mais doucement glisser plat avant en arrière dans une direction, puis arrêter et recommencer dans le sens perpendiculaire à répartir uniformément les complexes ADN-lipofectamine. Incuber pendant 90 minutes dans l'incubateur de culture tissulaire (37 ° C CO, 5% 2).
  7. Retourner lamelles pieds à l'envers, et organiser de sorte qu'ils ne se chevauchent pas. Permettre l'expression de procéder pour l'heure désirée, généralement durant la nuit à 48 heures.

Partie 2: Imagerie en direct de la GFP-marqués à noyau dense de vésicules dans des cultures de neurones de l'hippocampe

Matériel mis en place:

  1. L'imagerie de cellules vivantes nécessite un microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD, nous utilisons un Leica DMI 6000B microscope inversé équipé de la variable Leica, lampe fluorescente. Il faut également une chambre d'imagerie avec régulateur de température et un chauffe-objectif. Nous utilisons la Warner Instruments RC-21BR modifié pour une lamelle de 18 mm en plus d'un chauffe-plateforme (cat. # PH2) et régulateur de température (cat. # TC324B). La chambre ne contient pas de ports ouverts, une modification qui peut être inclus lors de la commande de la chambre. Un chauffe objectif est hautement recommandé pour aider à maintenir la température de la lamelle et minimiser les changements d'orientation, en raison des fluctuations de température. Les images sont acquises avec un Hamamatsu Orca-ER utilisant Metamorph (Molecular Devices) logiciels, y compris le 'streaming' mode d'acquisition de drop-in. Notez-Nous n'utilisons pas une chambre climatique qui enferme le microscope entier. Cet ajout est coûteux et pas nécessaire pour l'imagerie à court terme décrites ici.
  2. Autres équipements et réactifs comprennent fraîchement milieu préparé imagerie en temps réel (1X Hanks avec Ca 2 + et Mg 2 +, glucose 0,6%, et HEPES 10 mM), d'autres lamelles de verre de 18 mm, une pince stérile, non stérile forceps, Kimwipes, graisse à vide , et une seringue (sans aiguille ou avec modifiés wide-bore aiguille) avec lequel d'appliquer de la graisse.

Procédure:

  1. Préparer une solution fraîche moyennes imagerie en temps réel (1X Hanks avec Ca 2 + et Mg 2 +, glucose 0,6%, et HEPES 10 mM). Nous préparent habituellement 50ml à un moment et conserver à 4 o C lorsqu'il n'est pas utilisé. Il est préférable de préparer suffisamment pour pas plus d'une semaine à la fois. Environ 5-10 ml sont utilisés par plat de neurones.
  2. Démarrer microscope, caméra, lampe fluorescente, et un logiciel d'acquisition d'image. Également tourner sur la puissance de la plate-forme de la chambre et les chauffe-objectif.
  3. Préparer l'imaginezg de chambre.
    1. La chambre de Warner comporte un insert en Teflon pour le montage des lamelles. Pour la facilité de manipulation, l'étiquette d'un côté de l'insert "top" avec un marqueur permanent.
    2. Appliquer un anneau de graisse sur la rainure entourant le trou dans le côté de la chambre étiquetés "top". Évitez d'utiliser des excès comme il entrer dans la chambre et de réduire la zone observable.
    3. En utilisant des pinces, fixez un endroit propre, inutilisée de 18 cm lamelle à l'"top" côté de la chambre, appliquez une légère pression sur la lamelle à ses bords afin de créer un joint étanche à l'intérieur de la rainure en retrait de la chambre.
    4. Tourner la chambre au-dessus et appliquer une bague similaire de la graisse dans la rainure sur la face (en bas) côté de la chambre.
    5. Placez la chambre de prêt-bas vers le haut sur le couvercle d'un tube de 50 ml, qui est un titulaire de chambre idéale.
    6. Ajouter 750 ul de milieu de l'imagerie à la chambre. C'est une quantité excessive, mais la graisse doit empêcher que le milieu de se répandre et de l'excédent permettra d'éviter les bulles d'être pris au piège lorsque la lamelle de cellules-couverts est appliquée.
    7. Maintenir la chambre préparée dans le incubateur de culture tissulaire jusqu'à ce que nécessaire. Incubations prolongées, ~ 1 heure doit être évitée comme moyen d'imagerie va s'évaporer et le changement dans la composition.
  4. Effectuer l'assemblage final et la chambre imagerie des cellules vivantes.
    1. Déplacer la chambre préparée et un plat de lamelles transfectées par l'incubateur de la hotte de culture de tissus.
    2. L'ensemble de chambre final devrait être effectué rapidement pour assurer les cellules restent immergés dans le milieu et à 37 ° C en continu.
    3. En utilisant une pince stérile, retirez soigneusement une lamelle de l'antenne transfectées, toucher le bord de la lamelle à un Kimwipe pour entraîner un milieu de croissance.
    4. Placer la lamelle neurone à l'envers sur la chambre préparée. Tactile d'un côté de la lamelle à la graisse d'abord et appliquer une pression sur les bords d'apporter la lamelle à plat, sans bulles de piégeage. Moyennes imagerie excès se renverse comme prévu.
    5. Essuyez moyennes imagerie excès, mais attention à ne pas glisser les lamelles hors de position.
    6. Déplacer la chambre pour le chauffe-plateforme de pré-chauffée et fixez la chambre en place.
    7. Transfert de la chambre à la scène.
    8. Afin de réduire photoblanchiment et photoxicity, ajuster la lampe à la quantité minimum d'intensité nécessaire de trouver des cellules transfectées.
    9. Trouvez une cellule d'intérêt avec un objectif d'huile faible grossissement (40X). Il est bénéfique de s'en tenir à un modèle de recherche prévues pour assurer une couverture maximale et lamelle pour éviter des acquisitions d'images redondantes, par exemple, en haut à gauche de la lamelle, la numérisation de haut en bas de travail à la droite.
    10. Basculer vers un objectif de grossissement élevé du pétrole (60-100x) une fois un champ désiré a été localisé.
    11. Utilisez «acquisition stream" ou une fonction comparable de votre logiciel d'imagerie pour enregistrer une vidéo de la dynamique des protéines marqués à la fluorescence.
    12. Prenez une image de phase et d'autres images d'accompagnement (par exemple la GFP soluble) pour une analyse ultérieure et la présentation.
    13. Enregistrer toutes les images avant d'explorer la lamelle plus loin et l'enregistrement de la vidéo suivante.
    14. Généralement 3-5 vidéos d'un lamelle est considérée comme réussie. La phototoxicité et la santé des cellules générale devrait être gardé à l'esprit que le transport est réduite dans les cellules endommagées. La santé cellulaire peut être suivie par observation au microscope de phase. Typiquement enregistrements sont effectués pour environ 30 minutes par lamelle.

Partie 3: Résultats du représentant:

En direct les observations d'imagerie cellulaire sont généralement constitués de vidéos (aussi connu comme "piles" d'images) qui montrent le mouvement des organites fluorescence marqués dans le champ de vision (figure 1A). Accompagnant chaque vidéo sont souvent le soutien des images qui illustrent l'orientation du champ de vision à l'égard des corps de la cellule, le niveau d'expression des protéines et / ou la santé de la cellule. Vidéos de transport peuvent être soumis à une analyse quantitative par transformation d'kymographs (figure 1B). Kymographs sont des images qui illustrent le mouvement des particules en juxtaposant scans en ligne, où chaque point est représenté par une colonne de la kymographe. La figure 2 montre comment deux particules se déplaçant en sens inverse sont représentés dans un kymographe. Une analyse plus poussée des kymographs peut fournir des informations sur le flux de particules, la vitesse, longueur d'exécution, les inversions et des particules immobiles.


Figure 1. Représentant direct Observations d'imagerie cellulaire. (A) les cadres sélectionnés à partir d'un vidéo de mCherry-taggés Plasminogen activator (TPA) de transport. Les particules individuelles dans le mouvement antérograde (flèches vertes) et rétrograde (flèches rouges) les directions sont indiquées. (B) Kymographs illustrant TPA-mCherry mouvement dans leaxone. Les lignes horizontales dans les kymographs représenter des objets stationnaires, tandis que les lignes diagonales représentent les organites s'éloigner de (pente positive) ou vers (pente négative) du corps cellulaire. Les longues flèches vertes et rouges indiquent les pistes correspondant aux particules en (A). Les changements dans le transport en raison de la dépolymérisation des microtubules réactif, nocodazole, est également illustrée avec une kymographe. Notez la réduction des organites en mouvement par l'absence de lignes diagonales.

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Discussion

Imagerie des cellules vivantes est une technique difficile, mais puissant pour l'observation directe des transports en organite neurones en culture. Des difficultés peuvent survenir en amont de la procédure avec la santé des neurones pauvres à cause de complications de la culture. Par conséquent, la santé des cellules (pour des exemples voir réf. 4) devrait être évaluée avant et après la transfection par l'observation des lamelles alors que dans un milieu de croissance à l'aide d'un microscope optique de culture de tissu. Le processus de transfert des neurones contenant des lamelles à la chambre d'imagerie peut être stressant pour les cellules, il est donc important de faire preuve de prudence lors de la manipulation des lamelles. Il peut être commun pour les cellules d'apparence saine à montrer aucun transport en raison de retards dans la procédure, ou incomplètes de pré-chauffage de l'équipement ou l'équilibration des médias d'imagerie. Pour l'analyse du transport axonal et l'orientation dendritique doit être connu, à savoir distinguer le transport antérograde et rétrograde. Il est donc essentiel d'être sûr que l'emplacement d'un corps cellulaire est déterminée et qu'un segment continu neuronale peut être vu reliant la région d'intérêt pour le corps cellulaire. Souvent économiser chevauchement des images de la GFP soluble, ou informative nommer le fichier vidéo enregistré, est suffisant pour déterminer l'orientation du processus »pour les analyses, par exemple,« Cell1CellBodyUpperLeft ".

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Acknowledgments

Nous remercions Harald Hutter et Hélène Decker pour leur lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions également Reg Sidhu de Leica Microsystems pour son expertise technique. Cette recherche a été soutenue par les sciences naturelles et en génie du Canada, le Prix # 327100-06, et l'Université Simon Fraser Faculté des sciences.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine Reagent Mediatech, Inc. 10-010-CV
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-027 Transfection reagent
10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ Reagent GIBCO, by Life Technologies 14185-052 Live-imaging medium
1M HEPES Reagent GIBCO, by Life Technologies 15630-130 Live-imaging medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (29), 10011-10016 (2008).
  2. Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49, (6), 797-804 (2006).
  3. Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19, (1), 274-283 (2008).
  4. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, (5), 2406-2415 (2006).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.
Posted by JoVE Editors on 01/20/2010. Citeable Link.

A correction was made to Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

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