マイクロアレイ実験のためのジベレラzeae子嚢胞子の生産とコレクション。

Published 11/30/2006
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Biology

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Summary

ジベレラzeaeの子のう胞子の発達過程を調べるために、無菌条件下でのコレクションのための手順は、プロトコル記述のための情報の最高レベルを生成するために撮影されている。これは、実験、完全なゲノム発現プロファイルのテストが実装されている重要な側面の再現性を促進すべきである。

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Pasquali, M., Kistler, C. Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.. J. Vis. Exp. (1), e115, doi:10.3791/115 (2006).

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Abstract

フザリウムgraminearumシュワーベ(teleomorphジベレラzeae)が作物の収量と穀物の品質を減らし、小麦と大麦で黒星病を引き起こす植物病原体です。 F. graminearumはまた、トウモロコシの茎や耳の腐敗の原因となり、穀物などを汚染し、ヒトや家畜(ゴスワミやキスラー、2004)に有害なトリコテセンなどのマイコトキシンの生産者です。菌類は胞子の2つのタイプを生成します。子のう胞子は、有性生殖によって生じる繁殖体は、一次感染の主な情報源です。これらの胞子は、強制的に成熟した子のう殻から排出し、風(フランツルら1999)によって分散される。二次感染は、主に植物の表面に無性手段によって生成される大分生子によって引き起こされます。この菌の子のう胞子の発達過程を調べるために、無菌条件下での大量の彼らのコレクションのための手順が必要でした。我々のプロトコルが理解し、再現性のための情報の最高レベルを生成するために撮影された、重要な側面の完全なゲノムの遺伝子発現プロファイルが生成され、解釈されている場合。特に、子嚢胞子の発芽と生物活性の変動は、材料の前の操作に依存しています。子嚢胞子の生産のすべてのステップを文書化するためのビデオの使用は、マイクロアレイ解析のためのますます厳しい要件に準拠する、標準化を高めるために提案されている。手順は、標準的な実験装置を必要とします。手順は、汚染及び子のう胞子の好意の時刻同期を防ぐために示されている。

Protocol

  1. ニンジンの寒天(Klittichとレスリー、1988)9 cmの直径のペトリ皿に調製した。
  2. ポテトデキストロース寒天上に成長した新鮮な菌糸体を含む寒天の2mmの立方体は、各ペトリ皿の中央に塗布した。
  3. 培養は96時間、25 ° Cと12時間の光周期で増殖させた。
  4. 水溶液2.5パーセントのTween 60の1 mlを静かに押すことによって、文化の面(トレイルと共通、2000)に適用し、プラスチックの棒と文化に分散していた。
  5. 同じ日長で25℃で高湿度の環境で保管するときに子のう殻の撮影は、この誘導処理後7〜10日に開発された子のう胞子。
  6. 胞子コレクションは子のう殻は暗所で限られた時間(たとえば12時間)のために撮影して残して、ペトリ皿のふたを変更することにより行われます。
  7. 滅菌水を穏やかに表面に水を移動して子のう胞子を中断、蓋に追加されます。
  8. 子のう胞子は、滅菌ファルコンチューブに回収洗浄し、さらなる分析のために使用されています。

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Discussion

ここで紹介するプロトコルは、フザリウム属に対してperithecial生産のために使用前の手続きに基づいています。 (Klittichとレスリー、1988;トレイルと共通、2000)。子のう胞子(マイクロアレイ解析のための十分な)大量のが生成されたことで手順の標準化は、実験の再現性が不可欠だ。それは環境要因、年齢と基板の違いは、子のう胞子の生物学的特性(ベイヤーとVerreet、2005)を変更できることが報告されている。したがって、ビデオの使用は、再現性を容易にしてください胞子が生産され、収集される方法で、細部を強調することができる。特に、手順のビデオは、研究所間の標準化のレベルを向上させ、子嚢胞子の生産を必要とする全ゲノム転写研究の比較を容易にしてください。ペトリ皿の多数を同期的に処理する必要があるので、実験手順のために必要なRNAの量が比較的高いです。それは将来の実験のための標準を設定し、新しい生体材料に関する全ゲノム転写の研究を実施する必要があるときにビデオが特に適してツールです。

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Acknowledgements

著者は、優れた技術サポートのためにカレンヒルバーンに感謝。このプロジェクトは、米国農務省の共同国家研究、教育および拡張サービスの国立研究イニシアチブ(賞#2004-35604-14327)によってサポートされていました。マティアスパスカリはブランコワイスフェローシップでサポートされています。米国の小麦と大麦スカブイニシアティブは、研究の継続的な支援のために認められている。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Petri dish 9 cm diameter Tool
Tween 60 (20%) Reagent
Carrot agar (20% w/v organic carrots and 1.5% w/v agar) Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beyer, M., Verreet, J. A. Germination of Gibberella zeae ascospores as affected by age of spores after discharge and environmental factors. (2005).
  2. Francl, L., Shaner, G., Bergstrom, G., Gilbert, J., Pedersen, W., Dill-Macky, R., Sweets, L., Corwin, B., Jin, Y., Gallenberg, D., Wiersma, J. Daily inoculum levels of Gibberella zeae on wheat spikes. Plant Disease 83,662-666. (1999).
  3. Goswami, R. S., Kistler, H. C. Heading for disaster, Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology 5,515–525. (2004).
  4. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants in Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi. Genetics. 118, 417-2013 (1998).
  5. Trail, F., Common, R. Perithecium development in Gibberella zeae, a light microscopy study. (2000).
  6. Tschantz, A. T., Horst, R. L., Nelson, P. E. A substrate for uniform production of perithecia in Gibberella zeae. Mycologia. 67-1101 (1975).
  7. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. (1976).

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