نقل النووي في البويضات ماوس

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

والمقصود من هذا الفيلم والبروتوكول للمساعدة في نقل التعلم النووية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يمكن نقل النووي في بويضة غير مخصبة استعادة التنموية المحتملة للخلية متمايزة. هذا يدل على أن عمليات التنمية الأساسية ، والتمايز والشيخوخة هي اللاجينية بدلا من العمليات الجينية. على عكس هذه العمليات تفتح آفاقا مثيرة في البحوث الأساسية ، وأكثر في المستقبل البعيد ، في مجال الطب التجديدي. في الماوس ، يمكن اشتقاق خلايا جذعية جنينية من أجنة مستنسخة المرحلة سابق للانغراس. مثل الخلايا الجذعية الجنينية لديها القدرة على أن تؤدي إلى جميع أنواع الخلايا للكائن أخلاقي. الأهم من ذلك ، هذه الخلايا متطابقة وراثيا إلى الجهة المانحة. إذا كان ينطبق على الإنسان ، وهذا من شأنه أن يسمح للاشتقاق الخلايا الجذعية من المريض. ويمكن عندئذ أن تكون هذه الخلايا المتمايزة في نوع من الخلايا المتضررة للمريض ، ودرس في المختبر ، أو استخدامها لتحل محل الخلايا التالفة أو المفقودة. دراسة نقل النووي في الفأر لا يزال هاما لأنها يمكن أن تبلغنا عن مبادئ برمجة النووية. والمقصود من هذا الفيلم والبروتوكول المرافق له للمساعدة في تعلم نقل النووي في الفأر ، وهو أسلوب وضعت في البداية في مجموعة من Yanagimachi الأستاذ (اكاياما وآخرون 1998).

Protocol

التحضير :

  1. ويمكن العثور على وصف تفصيلي لفرط الإباضة وmicrodrop ثقافة الجنين في مكان آخر 2.
  2. إعداد طبق بتري مع microdrops من مستنبت جنين (على سبيل المثال KSOM ، Chemicon). مع تغطية الزيوت المعدنية (وينبغي اختبار دفعات الزيوت المعدنية من أجل التوافق مع ثقافة الجنين). يوازن في 37 درجة مئوية في الهواء بالإضافة إلى 5 ٪ CO 2. (وفي الحرارية الكترون الحاضنة للمياه 3110 تغلف أو ما يعادلها)
  3. إعداد طبق لعزل البويضات : قطرات مكان hepes مخزنة CZB وهيالورونيداز (0.1 ٪ ث / ت ، سيجما) في نصف الطبق وHCZB في النصف الآخر. مع تغطية الزيوت المعدنية. الحفاظ على طبق الحارة على مرحلة ساخنة من مجهر تشريح.
  4. تحضير المجهر : ضع ماصة بعقد القطر الخارجي للμ م حوالي 50 (أصغر قليلا من قطر البويضة) ، وفتح μ م حوالي 20 في حامل ماصة واحدة. ماصات عقد سهلة لجعل بالمعدات اللازمة ، ومجتذب إبرة (سوتر الآلات) وmicroforge (Narishige) ، ولكن يمكن أيضا أن تكون شراؤها من Humagen.

    تحميل 3-5 ل μ الزئبق في ذيل micropipette (الداخلية قطرها متر μ 8). تجنب تسرب الزئبق. إعداد الطبق مع قطرات صغيرة عدة في كل من 11 ٪ ث / ت PVP (بوفيدون) في HCZB و 5 μ غ / مل مثبط حركة الخلايا B في HCZB. استخدام غطاء طبق بيتري بدلا من الطبق نفسه غطاء لديه حافة القصير الذي لن تتدخل مع حركة عقد وماصات قلع. محاذاة ماصة عقد وقلع ماصة في انخفاض HCZB. نضح a HZCB قليلا الى غيض من ماصة القابضة.
  5. إعداد الخلايا المانحة يعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا والتجربة المحقق تعتزم القيام بها. بصفة عامة ، ينبغي أن يعامل الخلايا المانحة مع انزيم بروتين مثل التربسين وأبقى على الجليد للحد من الالتصاق حتى نقلها.
  6. الموت ببطء إنسانية الفئران 14-15 بعد ساعات من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية. ناقلة البيضات الحصاد وتشريح لها في قطرات HCZB - هيالورونيداز الدافئة. بعد تقريبا. 5 دقائق ، وسوف تكون حرة في الغالب البويضات من خلايا الركام. ثم ينبغي أن يكون غسلها عدة مرات في HCZB ، ثم غسلها مرة أخرى في قطرات KSOM قبل معايرتها ، ويوضع في الحاضنة حتى قلع.

استئصال

تتم المعالجات مع micromanipulators الهيدروليكية (Narishige) على مجهر مقلوب ، مثل TE200 نيكون. ويستخدم micromanipulator بيزو (Primetech) لحفر الشفافة زونا. ويمكن شراء شقة ذات الرؤوس وقلع ماصات نقل من Humagen. تنظيف وتليين ماصة قلع في قطرات PVP بطرد قطرات الزئبق المجهرية والشفط وطرد PVP. لمنع الالتصاق من الإبرة ، ينبغي أن يتم نفس الإجراء بين كل مجموعة من البويضات التي يتم منزوعة النواة أو نقلها.

وضع مجموعة صغيرة من البويضات في الانخفاض B - HCZB مثبط حركة الخلايا. وينبغي تكييف حجم المجموعة إلى مستوى من الخبرة من المحقق. لا ينبغي أن تبقى البويضات على المسرح لمدة أطول من 20-30 دقيقة. نقل الصكوك إلى قطرات B - HCZB مثبط حركة الخلايا. ينبغي جلب ماصة عقد وماصة استئصال متماشيا مع الطائرة الاستوائية من البويضة. هذا لن يكون ممكنا إذا كان لديه عقد ماصة قطرها الخارجي أصغر قليلا من البويضة نفسها. تدوير بويضة حتى يمكن رؤية المغزل الطورية الانكسار مختلفة. إذا كان مبتدئا لا تستطيع رؤية المغزل ، ويمكن التعرف على لوحة الطورية باستخدام الحمض النووي هويشت الصبغة والإضاءة فوق البنفسجية ، مع ذلك ، أنه لا يتوافق مع التطور الجنيني كفاءة. موقف المغزل الطورية في 3:00 والاحتفاظ بها بشكل جيد مع ماصة القابضة. تطبيق البقول بيزو لاختراق الشفافة زونا. لوحة اللمس الطورية مع ماصة قلع. مرة واحدة يمكن أن تكون مقاومة المغزل الطورية 'شعر' ، نضح المغزل وسحب الإبرة. السيتوبلازم البويضة هو السائل ، والمغزل الطورية التحركات ولكن كما أجمة عندما تطرق مع ماصة. في محاولة لتقليل كمية السيتوبلازم التي يتم إزالتها مع المغزل. بعد أن تم منزوعة النواة مجموعة من البويضات ، ويغسل لهم من خلال مستنبت جنين ووضعها في الحاضنة حتى نقلها. لا ينبغي أن بعض البويضات منزوعة النواة ولكن ينبغي أن يتم نقل وتفعيلها يكون بمثابة الرقابة لاستئصال. فإن هذه البويضات شظية في غضون عدة ساعات ، مشيرا إلى استئصال ناجحة.

نقل النووي

خلايا المكان الى حل PVP (11 ٪ في HCZB PVP). إذا كان كثير من الحيوانات المستنسخة القبض على خلية المرحلة 1 ، ينبغي خفض تركيز PVP إلى 5 ٪ أو أقل. خلايا المزيج جيدا الطرافةح PVP. تلتقط الخلايا مع ماصة مع القطر الداخلي أصغر قليلا من قطر الخلية. يجب على غشاء الخلية على كسر الطموح. في بعض الحالات ، يمكن استخدام طرد المتكررة والطموح فضلا عن تطبيق البقول بيزو لطيف لكسر الخلية المانحة. وينبغي بذل قطرة جديدة من الخلايا المانحة مع كل مجموعة من البويضات نقله ، والخلايا المانحة تصبح لزجة بعد بعض الوقت. حقن الخلايا المانحة بعد وقت قصير من كسر كسر الغشاء. لنقل ، والتركيز على متن الطائرة الاستوائية في البويضة نفسها بدلا من الطائرة الاستوائية من زونا الشفافة ، ونقل موقف وماصة عقد في نفس الطائرة. عقد البويضة بما في ذلك الجزء من السيتوبلازم لها بحزم. اختراق الشفافة زونا باستخدام نبضات بيزو. جعل النواة المانحة لغيض من ماصة ، ثم دفع غيض ماصة تقريبا إلى الجانب الآخر من بويضة منزوعة النواة ، على مقربة من ماصة عقد ، مما يجعل من ثلم في أعماق الخلية البيضية. نضح على كمية صغيرة جدا من السيتوبلازم البويضة في ماصة ، وتطبيق واحد بيزو نبض ضعيف لكسر غشاء البويضة ، إخراج النواة من الجهات المانحة ، وسحب الإبرة بسرعة بينما الشفط في غشاء هيولي في الطرف الأيمن من ثلم. في وقت واحد ، وسحب الإبرة والشفط ، وينبغي أن يكون من الممكن لإغلاق ثقب التي خلفها NT. وهذا الثقب إزالة "تقنية تقليل عدد البويضات التي ليز خلال NT. غسل البويضات بناؤها في KSOM وإعادتها إلى حاضنة لساعات 1-3.

تنشيط البويضة

تعد واحدة من نصف الطبق مع قطرات من الكالسيوم MCZB مجانا والنصف الآخر مع قطرات من الكالسيوم MCZB مجانا زائد 2 + 10MM الأب و 5 μ غ / مل مثبط حركة الخلايا B لكبح القطبية قذف الجسم. يوازن لمدة 30 دقيقة. CO 2 أقل من 5 ٪ في الهواء. يغسل جيدا في الأجنة NT - MCZB الكالسيوم الحرة ومكان لهم بعد ذلك في مجموعات صغيرة في قطرات مختلفة من الكالسيوم MCZB الحرة. عودة الطبق إلى حاضنة والثقافة لمدة 5-6 ساعات. للسيطرة على تفعيل بروتوكول للظروف اصطناعية والثقافة الجنين ، يجب استخدام البويضات غير منزوعة النواة. كما ستعمل على تطوير الاجنة بكرية التوالد. بعد التنشيط ، وغسل الأجنة من خلال أجنة KSOM وضعها في الحاضنة لمدة طويلة الأجل الثقافة. وينبغي أن تكون مرئية Pronuclei في هذه المرحلة الزمنية ، مشيرا إلى نقل ناجحة.

كتاب الطبخ الجنين الثقافة وسائل الإعلام

سيد الأملاح

تبدأ عالى النقاء 980 ​​مل O 2 H العقيمة في زجاجة 1 لتر

إضافة مكونات الجافة :

كلوريد الصوديوم 4760 ملغ (81mM) سيغما S - 5886
بوكل 360 ملغ (5mM) سيغما P - 5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 ملغ (1.18mM) سيغما M - 2773
KH 2 ص 160 4 ملغ (1.17mM) سيغما P - 5655
EDTA 2NA 40 ملغ (0.1mM) سيغما E - 6635
الجلوكوز (D) 1000 ملغ (و 5.5mm) سيغما G - 6152

إضافة مكونات السائل

NA - اكتات (حمض اللبنيك) 5.3 مل & نباهوجان ساماج ؛ سيغما 44263
Pen'Strep 10 مل Gibco 15140-122

للاملاح ألبوم MCZB :

فلتر تعقيم 500 مل أملاح الرئيسي (جيد لمدة 3-4 شهور ؛ المحل في 4 درجات مئوية)

للاملاح ألبوم HCZB :

تبدأ مع 500 مليلتر أملاح الرئيسية

إضافة 50 ملغم PVA (البارد للذوبان ؛ سيغما P - 8136)

يحرك المزيج لمدة 30-60 دقيقة ومعقمة تصفية (جيد لمدة 3 أشهر ؛ المحل في 4 درجات مئوية)

كاليفورنيا + + الحرة MCZB (لتنشيط البويضات في 5 ٪ CO 2)

تبدأ مع 99 مل من أملاح الأسهم MCZB

إضافة مكونات الجافة :


211 ملغ 3 NaHCO سيغما S - 5761

NA - البيروفات (حمض البيروفيك) 3 ملغ سيغما P - 4562

الجلوتامين L - 15mg سيغما G - 8540

ألبومين المصل البقري (BSA) 500 ملغ سيغما A - 3311

تذوب جميع المكونات حتى دوامة ؛ تصفية العقيمة.

HCZB (للالمجهرية في الغلاف الجوي المحيط)

تبدأ مع 99 مل من أملاح الأسهم HCZB

إضافة مكونات الجافة :


Hepes - 520 ملغ نا سيغما H - 3784

NaHCO 3 42 ملغ سيغما S - 5761

إضافة مكونات السائل :

128 ملي CaCl 2 (18.8g / لتر) 1 مل سيغما C - 7902

ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 مع حمض الهيدروكلوريك N 1

دوامة حتى المنحل ؛ تصفية العقيمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حظا سعيدا!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأود أن أشكر DE الدكتور إخفاء Akutsu لتقاسم له NT الحيل والدكتور ستيفن وسوليفان غاريت Birkhoff لقراءة نقدية للبروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics