माउस oocytes में न्यूक्लियर ट्रांसफर

Biology

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Summary

इस फिल्म और प्रोटोकॉल के परमाणु हस्तांतरण के सीखने में मदद करने का इरादा कर रहे हैं.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

एक unfertilized oocyte में परमाणु हस्तांतरण एक विभेदित सेल के विकास क्षमता को पुनर्स्थापित कर सकते हैं. यह दर्शाता है कि विकास, भेदभाव, और उम्र बढ़ने अंतर्निहित प्रक्रियाओं आनुवंशिक प्रक्रियाओं के बजाय epigenetic हैं. उलटने इन प्रक्रियाओं के बुनियादी अनुसंधान में रोमांचक दृष्टिकोण को खोलता है, और अधिक दूर के भविष्य में पुनर्योजी चिकित्सा में. माउस में, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के क्लोन preimplantation चरण भ्रूण से प्राप्त किया जा सकता है. इस तरह के भ्रूण स्टेम कोशिकाओं वयस्क जीव के सभी प्रकार की कोशिकाओं को जन्म देने की क्षमता है. महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं के आनुवंशिक दाता के लिए समान हैं. मानव को यदि लागू हो, यह एक मरीज से स्टेम कोशिकाओं की व्युत्पत्ति की अनुमति होगी. फिर इन कोशिकाओं को मरीज के प्रभावित कोशिका प्रकार में विभेदित किया जा सकता है और इन विट्रो में अध्ययन किया है, या क्षतिग्रस्त या लापता कोशिकाओं की जगह इस्तेमाल किया. माउस में परमाणु हस्तांतरण के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण बनी हुई है के रूप में यह हमारे परमाणु reprogramming की सिद्धांतों के बारे में सूचित कर सकते हैं. यह फिल्म और साथ प्रोटोकॉल माउस में परमाणु हस्तांतरण सीखने में मदद करने का इरादा कर रहे हैं, एक विधि शुरू प्रो Yanagimachi (1998 वाकायामा एट अल.) के समूह में विकसित.

Protocol

तैयारी:

  1. Superovulation और microdrop भ्रूण संस्कृति का एक विस्तृत वर्णन दो कहीं और पाया जा सकता है.
  2. भ्रूण मध्यम संस्कृति के microdrops (KSOM जैसे, Chemicon) के साथ एक पेट्री डिश तैयार है. खनिज तेल (खनिज तेल बैचों भ्रूण संस्कृति के साथ संगतता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए) के साथ कवर. 37 में संतुलित करना ° सी हवा से अधिक 5% सीओ 2 में. (थर्मो इलेक्ट्रॉन 3110 पानी तख्ताबंदीवाला इनक्यूबेटर या समकक्ष में)
  3. Oocytes के अलगाव के लिए एक डिश तैयार: hepes की बूँदें प्लेस और CZB hyaluronidase पकवान और दूसरी छमाही में HCZB के एक आधे में (0.1% w / ध्, सिग्मा) buffered. खनिज तेल के साथ कवर. पकवान एक विच्छेदन खुर्दबीन के एक गर्म मंच पर गर्म रखें.
  4. प्लेस के बारे में 50 μ मीटर (थोड़ा oocyte के व्यास से छोटी) के एक बाहरी व्यास के एक होल्डिंग पिपेट, और एक विंदुक धारक में μ के बारे में 20 मीटर की एक खोलने: खुर्दबीन तैयार करें . होल्डिंग pipettes आवश्यक उपकरण, एक सुई डांड़ी (Sutter उपकरण) और एक microforge (Narishige) के साथ बनाने के आसान हैं, लेकिन वे भी Humagen से खरीदा जा सकता है है.

    एक micropipette (भीतरी व्यास 8 μ मीटर) की पूंछ में 3-5 μ एल पारा लोड. पारा फैल से बचें. कई छोटे बूंदों के साथ 11% की प्रत्येक w / ध् HCZB में (polyvinylpyrrolidone) PVP और 5 / छ HCZB में मिलीलीटर cytochalasin बी μ एक पकवान तैयार. बजाय पकवान ही एक पेट्री डिश के ढक्कन का प्रयोग के रूप में ढक्कन एक छोटी रिम है कि पकड़े और enucleation pipettes के आंदोलन के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा. पकड़े और एक HCZB बूंद में enucleation विंदुक विंदुक संरेखित करें. पकड़े पिपेट की नोक में थोड़ा HZCB Aspirate.
  5. दाता कोशिकाओं की तैयारी कोशिका प्रकार और प्रयोग अन्वेषक प्रदर्शन करने का इरादा है पर काफी हद तक निर्भर करता है. सामान्य में, दाता कोशिकाओं trypsin जैसे एक proteolytic एंजाइम के साथ इलाज किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा करने के लिए स्थानांतरण जब तक चिपचिपाहट कम है.
  6. Humanely चूहों एचसीजी के प्रशासन के बाद 14-15 घंटे euthanize. हार्वेस्ट oviducts और उन्हें गर्म HCZB hyaluronidase बूंदों में काटना. के बाद लगभग 5 मिनट, oocytes ज्यादातर मेघपुंज कोशिकाओं से मुक्त हो जाएगा. वे तो HCZB में कई बार करना चाहिए धोया जा, तो पूर्व equilibrated KSOM बूँदें में आगे धोया, और enucleation तक मशीन में रखा है.

Enucleation

जोड़तोड़ हाइड्रोलिक micromanipulators, एक औंधा माइक्रोस्कोप पर (Narishige) Nikon TE200, जैसे के साथ किया जाता है. एक piezo micromanipulator (Primetech) zona pellucida ड्रिलिंग के लिए प्रयोग किया जाता है. फ्लैट इत्तला दे दी enucleation और हस्तांतरण pipettes Humagen से खरीदा जा सकता है. स्वच्छ और सूक्ष्म पारा बूंदों को खदेड़ने और aspirating और PVP expelling द्वारा PVP बूंदों में enucleation विंदुक चिकना. सुई की चिपचिपाहट को रोकने के लिए, समान प्रक्रिया का oocytes कि या enucleated हैं हस्तांतरित के प्रत्येक समूह के के बीच किया जाना चाहिए.

HCZB cytochalasin बी बूंद में oocytes के एक छोटे समूह रखें. समूह के आकार अन्वेषक के अनुभव के स्तर के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. Oocytes मंच पर 20-30 मिनट से अधिक समय के लिए नहीं रखा जाना चाहिए. HCZB cytochalasin बी बूँदें यंत्र हटो. पकड़े पिपेट और enucleation विंदुक oocyte के भूमध्यवर्ती विमान के साथ संरेखण में लाया जाना चाहिए. यह संभव हो सकता है अगर पकड़े विंदुक एक बाहरी व्यास है कि थोड़ा oocyte ही की तुलना में छोटे है है. एक oocyte घुमाएँ जब तक अलग अपवर्तक मेटाफ़ेज़ धुरी देखा जा सकता है है. यदि एक शुरुआत धुरी नहीं देख सकते हैं, मेटाफ़ेज़ प्लेट डीएनए डाई Hoechst और यूवी रोशनी, तथापि, कि कुशल भ्रूण के विकास के साथ संगत नहीं है का उपयोग कर पहचाना जा सकता है है. 3 बजे मेटाफ़ेज़ धुरी स्थिति और यह पकड़े विंदुक के साथ अच्छी तरह से पकड़. लागू piezo दालों zona pellucida घुसना. Enucleation विंदुक के साथ मेटाफ़ेज़ प्लेट टच. एक बार मेटाफ़ेज़ धुरी के प्रतिरोध 'महसूस' कर सकते हैं, धुरी aspirate और सुई वापस लेने. oocyte cytoplasm तरल पदार्थ है, मेटाफ़ेज़ धुरी लेकिन एक पेड़ों का झुरमुट के रूप में चलता है जब विंदुक के साथ छुआ. Cytoplasm कि धुरी के साथ हटा दिया जाता है की राशि को कम करने की कोशिश करो. Oocytes के एक समूह के बाद enucleated किया गया है, उन्हें भ्रूण संस्कृति के माध्यम से धोने और उन्हें हस्तांतरण जब तक इनक्यूबेटर में जगह. Enucleated कुछ oocytes लेकिन स्थानांतरित नहीं सक्रिय होना चाहिए चाहिए और enucleation के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. कई घंटे के भीतर इन oocytes टुकड़ा, सफल enucleation का संकेत है.

परमाणु हस्तांतरण

PVP समाधान (11% HCZB में PVP) में प्लेस कोशिकाओं. यदि एक सेल चरण में कई क्लोनों गिरफ्तारी, PVP एकाग्रता 5% या उससे कम करने के लिए कम होना चाहिए. अच्छी तरह मिक्स कोशिकाओं बुद्धिघंटे PVP. एक आंतरिक व्यास थोड़ा सेल के व्यास से छोटी के साथ एक विंदुक के साथ कोशिकाओं उठाओ. आकांक्षा पर सेल की झिल्ली तोड़ देना चाहिए. कुछ मामलों में, दोहराए expelling और आकांक्षा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कोमल piezo दालों के आवेदन दाता कोशिका को तोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दाता कोशिकाओं का एक नया ड्रॉप स्थानांतरित किया जा रहा oocytes के प्रत्येक समूह के साथ किया जाना चाहिए, दाता कोशिकाओं के रूप में कुछ समय के बाद चिपचिपा हो जाते हैं. झिल्ली को तोड़ने के बाद शीघ्र ही टूट दाता सेल इंजेक्षन. हस्तांतरण के लिए oocyte ही बजाय zona pellucida के भूमध्यवर्ती विमान के भूमध्यरेखीय हवाई जहाज़ पर ध्यान देते हैं, और हस्तांतरण और एक ही विमान में पकड़े विंदुक स्थिति. इसके cytoplasm का एक हिस्सा मजबूती सहित oocyte पकड़ो. Zona pellucida घुस्साघुस्सी piezo दालों का उपयोग. विंदुक टिप दाता नाभिक लाओ, तो लगभग enucleated oocyte के विपरीत पक्ष विंदुक टिप धक्का, पकड़े विंदुक के करीब oocyte में एक गहरे कुंड बना. Aspirate पिपेट में oocyte cytoplasm से एक बहुत छोटी राशि, एक एकल कमजोर piezo oocyte झिल्ली तोड़ पल्स लागू, दाता नाभिक बेदखल करना, सुई तेजी से वापस लेने जबकि कुंड का सही अंत में cytoplasmic झिल्ली पर aspirating. एक साथ सुई वापस लेने और aspirating करके, यह संभव हो सकता NT से पीछे छोड़ दिया छेद को बंद करने चाहिए. 'यह छेद को हटाने की तकनीक oocytes है कि NT के दौरान lyse की संख्या कम हो जाएगा. KSOM में खंगाला oocytes धो और इनक्यूबेटर उन्हें 1-3 घंटे के लिए वापसी.

Oocyte सक्रियण

कैल्शियम मुक्त MCZB की बूंदों और कैल्शियम मुक्त MCZB प्लस 10mm 2 सीनियर की बूंदों के साथ अन्य आधे के साथ एक डिश के एक आधे तैयार + और ​​5 छ / मिलीलीटर cytochalasin बी μ ध्रुवीय शरीर बाहर निकालना बाधित है. 30 मिनट के लिए संतुलित. 5 के तहत% हवा में सीओ 2. NT भ्रूण कैल्शियम मुक्त MCZB में अच्छी तरह धो लें फिर कैल्शियम - मुक्त MCZB के विभिन्न बूंदों में छोटे - छोटे समूहों में उन्हें जगह. इनक्यूबेटर और संस्कृति के लिए 5-6 घंटे के लिए पकवान लौटें. कृत्रिम सक्रियण प्रोटोकॉल के लिए और भ्रूण संस्कृति की स्थिति के लिए नियंत्रण करने के लिए, गैर - enucleated oocytes किया जाना चाहिए. वे parthenogenetic भ्रूण के रूप में विकसित होगा. सक्रियण के बाद, लंबी अवधि संस्कृति के लिए KSOM और जगह भ्रूण के माध्यम से भ्रूण इन्क्यूबेटर में धो. Pronuclei इस समय बिंदु पर दिखाई देता हो, सफल स्थानान्तरण का संकेत चाहिए.

भ्रूण संस्कृति मीडिया रसोई की किताब

मास्टर साल्ट

बाँझ 1 एल बोतल में 980 एमएल ultrapure एच 2 हे के साथ शुरू

सूखी घटकों को जोड़ें:

4760 मिलीग्राम (81mM) सिग्मा NaCl एस ५८८६
KCl 360 मिलीग्राम (5mm) सिग्मा पी 5405
4 MgSO • 7 2 हे 290 मिलीग्राम (1.18mM) एम +२७७३ सिग्मा
के.एच. 2 पीओ 4 160 (1.17mM) मिलीग्राम सिग्मा पी 5655
EDTA 40 मिलीग्राम (0.1mm) सिग्मा 2NA ई 6635
ग्लूकोज (डी) 1000 मिलीग्राम (5.5mm) जी 6152 - सिग्मा

तरल अवयव जोड़ें

ना-लैक्टेट (लैक्टिक एसिड) 5.3 एमएल और nबसपा, 44263 सिग्मा
Pen'Strep 10 एमएल Gibco 15140-122

MCZB स्टॉक साल्ट के लिए:

बाँझ 500 एमएल मास्टर लवण (4 बजे दुकान ° सी 3-4 महीने के लिए अच्छा) फ़िल्टर

HCZB स्टॉक साल्ट के लिए:

500 एमएल मास्टर लवण के साथ प्रारंभ करें

(; सिग्मा पी 8136 ठंड में घुलनशील) 50 मिलीग्राम PVA जोड़ें

30-60 मिनट और फिल्टर बाँझ (4 बजे दुकान ° सी 3 महीने के लिए अच्छा है) के लिए हिलाओ

Ca + + मुफ्त MCZB (5% सीओ 2 में oocytes सक्रियण के लिए )

99 एमएल MCZB शेयर नमक के साथ शुरू

सूखी घटकों को जोड़ें:


NaHCO 3 211 मिलीग्राम एस ५७६१ - सिग्मा

ना - पाइरूवेट (Pyruvic एसिड) 3 मिलीग्राम पी +४,५६२ सिग्मा

एल-Glutamine 15mg जी 8540 - सिग्मा

गोजातीय सीरम albumin (BSA) 500 मिलीग्राम एक 3311 सिग्मा

बाँझ फिल्टर, जब तक सभी घटकों भंवर भंग कर रहे हैं.

HCZB (परिवेश के वातावरण में micromanipulation के लिए )

99 एमएल HCZB शेयर नमक के साथ शुरू

सूखी घटकों को जोड़ें:


Hepes ना 520 मिलीग्राम एच +३७८४ सिग्मा

NaHCO 3 42 मिलीग्राम एस ५,७६१ - सिग्मा

तरल घटक जोड़ें:

128 मिमी 2 CaCl (18.8g / एल) 1 एमएल सिग्मा सी ७९०२

7,5 करने के लिए एन 1 एचसीएल के साथ पीएच समायोजित

जब तक भंवर भंग, बाँझ फिल्टर.

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Discussion

गुड लक!

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Acknowledgments

डे प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए अपने NT चालें और डॉ. स्टीफन सुलिवान और गैरेट Birkhoff साझा करने के लिए डॉ. छिपाएँ Akutsu धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

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References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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