マウス卵母細胞への核移転

Biology

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Summary

この映画とプロトコルは、核移植を学習することを目的としています。

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

未受精卵卵母細胞への核移植は、分化した細胞への発達の可能性を復元することができます。これは、開発、差別化と高齢化の根底にあるプロセスはむしろ遺伝的プロセスよりもエピジェネティックであることを示している。これらのプロセスの可逆性は、再生医療では、基礎研究に、そしてより遠い将来のエキサイティングな展望を開きます。マウスでは、胚性幹細胞は、クローニングされた着床前の段階の胚に由来することができます。このような胚性幹細胞は成体生物のすべての細胞型を生じさせる能力を持っている。重要なことは、これらの細胞は、ドナーと遺伝的に同一です。人間に適用する場合、これは患者から幹細胞の派生を可能​​にするであろう。これらの細胞は、患者の患部の細胞型に分化し、in vitroで研究、または破損または不足している細胞を置き換えるために使用することができる。それが核初期化の原理についての私達に知らせることができるようにマウスの核移植の研究は依然として重要である。この映画とそれに付随するプロトコルは、マウスで最初に教授柳町(和歌山ら、1998)のグループで開発された方法を核移植を学習することを目的としています。

Protocol

準備:

  1. 排卵とmicrodrop胚培養の詳細な説明は別の場所で2見つけることができます。
  2. 胚培養培地のmicrodrops(例えばKSOM、Chemicon社)を持つペトリ皿を準備します。鉱物油(ミネラルオイルのバッチが胚培養との互換性についてテストする必要がある)でカバー。 37平衡で空気プラス5%CO 2でC。 (サーモエレクトロン3110水ジャケットインキュベーターまたは同等の)
  3. 卵母細胞の単離のための料理を準備します。HEPESの場所降下は、他の半分の料理とHCZBの半分にCZB&ヒアルロニダーゼ(0.1%w / vの、Sigma)をバッファ。ミネラルオイルで覆う。解剖顕微鏡の加熱ステージ上皿、冷えないように保管してください。
  4. 場所は約50μM(卵母細胞の直径よりやや小さい)の外径のホールディングピペット、一ピペットホルダーで約20μmの開放:顕微鏡を準備します。ホールディングピペットは、必要な設備、ニードルプラー(サッタインスツルメンツ)とマイクロフォージ(ナリシゲ)で作るのは簡単ですが、彼らはまたHumagenから購入することができる。

    マイクロピペット(内径8μmの )の尾部に3〜5μlの水銀をロードする。水銀の流出を避ける。いくつかの小滴11%の各HCZBのw / vのPVP(ポリビニルピロリドン)、5μHCZBでg / mlのサイトカラシンBで料理を準備します。蓋が保持して除核ピペットの動きを妨げないショートリムを持っているとして、ペトリ皿の蓋ではなく、料理そのものを使用してください。 HCZBドロップでホールディングピペットと除核ピペットを合わせます。ホールディングピペットの先端に少しHZCBを吸引除去する。
  5. ドナー細胞の調製は、主に細胞の種類や研究者が行おうとする実験に依存する。一般的には、ドナー細胞は、トリプシンなどのタンパク分解酵素で処理し、転送するまで粘りを減らすために氷上で保存する。
  6. 人道的に14〜15時間hCGの投与後にマウスを安楽死させる。収穫の輸卵管と暖かいHCZB -ヒアルロニダーゼ滴でそれらを詳細に分析します。約後。 5分、卵母細胞は卵丘細胞から主にフリーになります。そして、彼らはその後、予め平衡KSOM滴でさらに洗浄し、HCZBで数回洗浄し、そして核出術まで、インキュベーターで維持する必要があります。

摘出

操作は、ニコンTE200のような倒立顕微鏡上に油圧マイクロマニピュレーター(成茂)、で行われます。ピエゾマイクロマニピュレータ(プライムテック)は、透明帯を掘削するために使用されます。フラット先端脱核し、転送ピペットはHumagenから購入することができます。微視的な水銀の液滴を追放してして吸引し、PVPを追い出すことによってPVPドロップ内の除核ピペットを清掃し、注油。針の粘着性を防止するために、同じ手順がどちら摘出または転送される卵母細胞の各グループの間で行われる必要があります。

HCZB -サイトカラシンBのドロップに卵母細胞の小さなグループを置きます。グループのサイズは、治験責任医師の経験のレベルに調整する必要があります。卵母細胞は20〜30分よりも長く舞台上のままにしてはいけません。 HCZB -サイトカラシンBの低下に楽器を移動します。ホールディングピペットと除核ピペットを卵母細胞の赤道面に整列するように課されるべき。ホールディングピペットを卵母細胞自体よりわずかに小さい外径を持つ場合、これが可能になります。異なる屈折中期紡錘体が見られるようになるまで卵母細胞を回転させます。初心者にはスピンドルが表示されない場合は、中期プレートがDNA色素ヘキストとUV照明を使用して識別することができます、しかし、それは効率的な胚発生との互換性がありません。 3時位置に分裂中期紡錘体を配置し、ホールディングピペットでよく、それを保持する。透明帯を貫通してピエゾパルスを印加して下さい。脱核のピペットと中期板をタッチ。中期紡錘体の抵抗を"感じる"ことができると、スピンドルを吸引して針を撤回。ピペットで触れたとき、卵母細胞の細胞質は液体であり、中期紡錘体は、しかし、塊として移動します。スピンドルで除去される細胞質の量を減らすようにしてください。卵母細胞のグループが摘出された後に、胚の培養液を介してそれらを洗浄し、転送するまで、インキュベーターに入れます。いくつかの除核卵母細胞を転送すべきではありませんが、アクティブと核出術のためのコントロールとして使用されるべきである。これらの卵母細胞は、数時間内のフラグメント、成功した核出術を示すでしょう。

核移動

PVP溶液(11%HCZBのPVP)に場所細胞。 1セルの段階で多くのクローンが逮捕した場合、PVPの濃度は5%以下にまで低減されるべきである。細胞を混ぜてよくウィットH PVP。細胞の直径よりも僅かに小さい内径を持つピペットで細胞を拾う。細胞の膜は、吸引時にブレークします。いくつかのケースでは、反復的な追放や誤嚥だけでなく、穏やかなピエゾパルスの印加は、ドナー細胞を破壊するために使用することができます。ドナー細胞は、しばらく後にスティッキーになるようにドナー細胞の新たな低下は、転送される卵母細胞の各グループで行う必要があります。膜を破壊した直後に壊れたドナー細胞を注入する。転送の場合は、卵母細胞そのものではなく、透明帯の赤道面の赤道面に焦点を当て、同一平面に転送し、ホールディングピペットを置きます。しっかりと細胞質の一部を含む、卵母細胞を保持する。ピエゾのパルスを用いて透明帯を貫通する。ほとんど除核卵母細胞の反対側にピペットチップをプッシュして、ピペットの先端にドナー核を持って、卵母細胞に深い溝を作り、ホールディングピペットに近い。ピペットに卵母細胞の細胞質の非常に少量を吸引、、卵母細胞膜を破壊するために、単一の弱いピエゾパルスを適用するドナーの核を取り出し、畝の右端にある細胞質膜で吸引しながら急速に針を撤回。同時に針を撤回し、吸引し、それは、NTが残した穴を閉じることができるはずです。この"穴の除去技術は、NT中に溶解卵母細胞の数が削減されます。 KSOMに再建された卵母細胞を洗浄し、1〜3時間インキュベーターに戻す。

卵母細胞の活性化

極体の押出成形を阻害するためのカルシウム遊離MCZBとカルシウムフリーMCZBプラス10mMののSr 2 +、5μg / mlのサイトカラシンBの液滴と残りの半分の液滴と皿の半分を準備します。 30分間平衡化させます。空気中5%CO 2下で。カルシウムフリーMCZBでもNTの胚を洗浄し、カルシウムを含まないMCZBの異なる滴の小さなグループに配置します。 5〜6時間インキュベーターと文化に皿を返す。人工的な活性化のプロトコルのためにと胚の培養条件を制御するために、非除核卵母細胞を使用する必要があります。彼らは、単為生殖胚として開発します。活性化に続いて、長期培養用インキュベーターでKSOMと場所胚を通じて胚を洗浄する。前核は、転送が成功したことを示し、この時点で表示されるはずです。

胚培養のメディアのクックブック

マスターの塩

滅菌1リットルボトル980 mLの超純H 2 Oで始まる

乾燥成分を追加します。

NaClの4760ミリグラム(81mM)シグマS - 5886
塩化カリウム360mgの(5mm)のシグマP - 5405
し、MgSO 4•7H 2 O 290 mgを(1.18mM)シグマM - 2773
KH 2 PO 4 160mgを(1.17mM)シグマP - 5655
EDTA 2NAに40mg(0.1mm単位)シグマE - 6635
ブドウ糖(D)は1000mg(5.5mmの)シグマG - 6152

液体コンポーネントの追加

NA -乳酸(乳酸)5.3 mLの&NBSPは、シグマ44263
Pen'Strep 10mLのギブコ15140から122

MCZBストック塩の場合:

500mLのマスター塩(、4℃で保存3-4ヶ月に良い)を滅菌フィルタリング

HCZBストック塩の場合:

500mLのマスター塩で始まります

(;シグマP - 8136冷溶性)50mgのPVAを追加

30〜60分間とフィルター滅菌(、4℃で保存3ヶ月に良い)のためにかき混ぜる

のCa + +フリーMCZB(5%CO 2の卵母細胞の活性化のための)

99 mLのMCZBストック塩で始まります

乾燥成分を追加します。


NaHCO 3の 211 mgのシグマS - 5761

のNa -ピルビン酸(ピルビン酸)3mgのシグマP - 4562

L -グルタミン15mgシグマG - 8540

ウシ血清アルブミン(BSA)500mgのシグマ- 3311

すべてのコンポーネントまでの渦巻きが溶解され、滅菌フィルターを。

HCZB(周囲の大気中のマイクロマニピュレーションのための)

99 mLのHCZBストック塩で始まります

乾燥成分を追加します。


HEPES - Naは520 mgのシグマH - 3784

NaHCO 3の 42 mgのシグマS - 5761

液体成分を追加します。

128 mMのCaCl 2の (18.8グラム/リットル)を1 mLシグマC - 7902

1 N HClでpHを7.5に調整する

溶解するまで渦巻き、滅菌フィルター。

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Discussion

幸運を祈る!

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Acknowledgments

DEは、プロトコルの重要な読書のための彼のNTのトリックと博士スティーブンサリバンとギャレットバーコフを共有するための博士隠す阿久津に感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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