Transferencia nuclear en ovocitos de ratón

Biology

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Summary

Esta película y el protocolo se pretende ayudar al aprendizaje de la transferencia nuclear.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

La transferencia nuclear en un ovocito no fertilizado puede restablecer el potencial de desarrollo de una célula diferenciada. Esto demuestra que los procesos que subyacen al desarrollo, la diferenciación y el envejecimiento son epigenéticos en lugar de los procesos genéticos. La reversibilidad de estos procesos se abre perspectivas interesantes en la investigación básica, y en el futuro más lejano, en la medicina regenerativa. En el ratón, las células madre embrionarias se pueden derivar de la clonación de embriones de preimplantación etapa. Estas células madre embrionarias tienen la capacidad de dar lugar a todos los tipos celulares del organismo adulto. Es importante destacar que estas células son genéticamente idénticos al donante. Si es aplicable a humanos, esto permitirá la obtención de células madre de un paciente. Estas células podrían entonces ser diferenciado en el tipo de células afectadas del paciente y estudio in vitro, o se utiliza para reemplazar las células dañadas o faltantes. El estudio de la transferencia nuclear en el ratón sigue siendo importante ya que nos puede informar acerca de los principios de la reprogramación nuclear. Esta película y el protocolo de acompañamiento están destinadas a ayudar al aprendizaje de la transferencia nuclear en el ratón, un método desarrollado inicialmente en el grupo del Prof. Yanagimachi (Wakayama et al. 1998).

Protocol

Preparaciones:

  1. Una descripción detallada de superovulación y cultivo de embriones microgota se puede encontrar en otro lugar 2.
  2. Prepare una placa de Petri con microgotas de medio de cultivo de embriones (por ejemplo, KSOM, Chemicon). Cubrir con aceite mineral (lotes de aceite mineral deben ser probados para la compatibilidad con el cultivo de embriones). Equilibre a 37 ° C en el aire, más el 5% de CO 2. (En Thermo Electron-agua incubadora con camisa de 3110 o su equivalente)
  3. Preparar un plato para el aislamiento de los ovocitos: gotas Lugar de HEPES buffer CZB y hialuronidasa (0,1% w / v, Sigma) en la mitad del plato y HCZB en la otra mitad. Cubrir con aceite mineral. Mantener el plato caliente en una fase caliente de un microscopio de disección.
  4. Prepare el microscopio: Coloque una pipeta de sujeción de un diámetro exterior de μ m 50 (ligeramente más pequeño que el diámetro de los ovocitos), y una abertura de unos 20 m μ en un soporte de pipeta. Pipetas de la celebración son fáciles de hacer con el material necesario, un extractor de aguja (Sutter Instruments) y una microforge (Narishige), pero también pueden ser comprados en Humagen.

    La carga de mercurio 3-5 μ l en la cola de una micropipeta (diámetro interior de 8 m μ). Evitar los derrames de mercurio. Preparar un plato con varias pequeñas gotas de cada uno de 11% w / v PVP (polivinilpirrolidona) en HCZB y 5 μ g / ml de citocalasina B en HCZB. Use la tapa de una placa de Petri en lugar del propio plato como la tapa tiene un borde corto que no interfiera con el movimiento de la explotación y las pipetas enucleación. Alinear la pipeta de sujeción y la pipeta de la enucleación, en una caída HCZB. Aspirar una HZCB poco en la punta de la pipeta de sujeción.
  5. Preparación de las células del donante depende en gran medida del tipo celular y el experimento, el investigador tiene la intención de llevar a cabo. En general, las células del donante debe ser tratado con una enzima proteolítica, tales como la tripsina y se mantienen en hielo para reducir la viscosidad hasta que la transferencia.
  6. Humanamente eutanasia ratones 14-15 horas tras la administración de hCG. Oviductos de la cosecha y la disección en la cálida HCZB-hialuronidasa gotas. Después de aprox. 5 minutos, los ovocitos serán en su mayoría libres de células del cumulus. A continuación, se deben lavar varias veces en HCZB, luego se lava más las gotas KSOM pre-equilibrio, y se mantienen en la incubadora hasta la enucleación.

Enucleación

Las manipulaciones se hacen con micromanipulador hidráulico, (Narishige) en un microscopio invertido, como la Nikon TE200. Un micromanipulador piezo (PrimeTech) se utiliza para la perforación de la zona pelúcida. De punta plana enucleación y pipetas de transferencia se pueden comprar en Humagen. Limpiar y lubricar la pipeta enucleación en las gotas de PVP por la expulsión de gotas microscópicas de mercurio y aspirando y expulsando a PVP. Para evitar que la viscosidad de la aguja, el mismo procedimiento que se debe hacer entre cada grupo de ovocitos que son enucleados o transferidos.

Coloque un pequeño grupo de ovocitos en la caída de HCZB-citocalasina B. El tamaño del grupo debe adaptarse al nivel de experiencia del investigador. Ovocitos no debe mantenerse en el escenario durante más de 20-30 minutos. Mover los instrumentos para que las gotas HCZB-citocalasina B. La pipeta de sujeción y la pipeta enucleación debe ser puesto en la alineación con el plano ecuatorial de los ovocitos. Esto será posible si la pipeta de sujeción tiene un diámetro exterior que es ligeramente más pequeño que el ovocito. Girar un ovocito hasta el eje de la metafase diferente de refracción puede ser visto. Si un principiante no puede ver el eje, el plato de metafase pueden ser identificados utilizando el ADN colorante Hoechst y la iluminación UV, sin embargo, que no es compatible con el desarrollo embrionario eficiente. La posición del eje de la metafase a las 3 y manténgalo bien con la pipeta de sujeción. Aplicar pulsos piezo para penetrar la zona pelúcida. Toque la placa de la metafase con la pipeta de la enucleación. Una vez que la resistencia del eje de la metafase se puede 'sentir', aspirar el eje y retirar la aguja. El citoplasma del ovocito es fluido, el eje de la metafase sin embargo se mueve como un grupo cuando se toca con la pipeta. Trate de reducir la cantidad de citoplasma que se elimina con el eje. Después de un grupo de ovocitos ha sido enucleado, lavarlos por medio de cultivo de embriones y se colocan en la incubadora hasta que la transferencia. Algunos ovocitos enucleados no deberían ser transferidos, pero debe ser activada y actuar como un control de enucleación. Estos ovocitos se fragmento en cuestión de horas, lo que indica la enucleación exitosa.

La transferencia nuclear

Células de lugar en PVP solución (11% PVP en HCZB). Si el paro muchos clones en la fase 1 de las células, la concentración de PVP se reduce a 5% o menos. Mezclar bien las células ingenioh PVP. Recoger las células con una pipeta con un diámetro interior ligeramente más pequeño que el diámetro de la célula. La membrana de la célula se rompe encima de la aspiración. En algunos casos, la expulsión repetitiva y aspiraciones, así como la aplicación de suaves impulsos piezoeléctricos se pueden utilizar para romper las células de los donantes. Una nueva caída de las células del donante se debe hacer con cada grupo de ovocitos que se transfiere, como las células del donante se vuelven pegajosos después de algún tiempo. Se inyecta la célula donante roto poco después de la ruptura de la membrana. Para la transferencia, se centran en el plano ecuatorial de la propia ovocitos en vez de el plano ecuatorial de la zona pelúcida, y la posición de la transferencia y la pipeta de sujeción en el mismo plano. Mantener el ovocito, incluyendo una parte de su citoplasma con firmeza. Penetrar la zona pelúcida mediante pulsos piezo. Llevar el núcleo de donantes a la punta de la pipeta, a continuación, empuje la punta de la pipeta casi al lado opuesto del ovocito enucleado, cerca de la pipeta de sujeción, haciendo un surco profundo en el ovocito. Aspirar una pequeña cantidad de citoplasma del ovocito en la pipeta, se aplican un solo pulso débil piezo para romper la membrana del ovocito, expulsar el núcleo donante, retire la aguja con rapidez mientras se aspira a la membrana citoplasmática en el extremo derecho del surco. Al mismo tiempo de retirar la aguja y aspirar, debe ser posible para cerrar el hueco dejado por NT. Esta técnica agujero "eliminación reducirá el número de ovocitos que lisan en NT. Lavado de los ovocitos reconstruidos en KSOM y devolverlos a la incubadora durante 1-3 horas.

Ovocito de activación

Prepare una media de un plato con gotas de calcio MCZB libre y la otra mitad con gotas de calcio MCZB gratuito, además de 10 mM Sr 2 + y 5 μ g / ml de citocalasina B para inhibir la extrusión cuerpo polar. Equilibrar durante 30 min. menos del 5% de CO 2 en el aire. Lavado de embriones NT y en el calcio libre MCZB y luego colocarlos en pequeños grupos en diferentes gotas de calcio libre MCZB. Devolver el plato a la incubadora y la cultura durante 5-6 horas. Para el control para el protocolo de activación artificial y de las condiciones de cultivo de embriones, ovocitos enucleados no deben ser utilizados. Van a desarrollar los embriones partenogenética. Después de la activación, lavar los embriones a través de embriones KSOM y lugar en la incubadora a largo plazo de la cultura. Pronúcleos debe ser visible en este punto del tiempo, lo que indica una transferencia exitosa.

Medios de cultivo de embriones Cookbook

Sales maestro

Comience con 980 ml ​​ultrapura H 2 O en un frasco estéril L

Añadir los componentes secos:

NaCl 4,760 mg (81 mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5 mM) Sigma P-5405
MgSO4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glucosa (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Agregar componentes líquidos

Na-lactato (ácido láctico) 5,3 ml & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 ml Gibco 15140-122

Para las sales de archivo MCZB:

Filtro de esterilización de 500 ml sales maestro (bueno para los 3-4 meses, se almacenan a 4 ° C)

Para las sales de archivo HCZB:

Iniciar con 500 ml sales maestro

Añadir 50 mg PVA (frío-soluble, Sigma P-8136)

Agitar durante 30-60 minutos y filtro estéril (bueno para 3 meses, se almacenan a 4 ° C)

Ca + + libre MCZB (para la activación de ovocitos en el 5% CO 2)

Comience con 99 ml de archivo sales MCZB

Añadir los componentes secos:


NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761

Na-piruvato (ácido pirúvico) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamina 15 mg Sigma G-8540

Albúmina de suero bovino (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Agitar hasta que todos los componentes están disueltos, filtro estéril.

HCZB (por micromanipulación en la atmósfera de ambiente)

Comience con 99 ml de archivo sales HCZB

Añadir los componentes secos:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO3 42 mg Sigma S-5761

Añadir componentes líquidos:

128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 ml de Sigma C-7902

Ajustar el pH a 7,5 con HCl 1 N

Remolino hasta que se disuelva; filtro estéril.

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Discussion

¡Buena suerte!

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Acknowledgments

DE gustaría agradecer al Dr. Ocultar Akutsu para compartir sus trucos NT y el Dr. Stephen Sullivan y Garrett Birkhoff para la lectura crítica del protocolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

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References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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