Transfert nucléaire dans des ovocytes de la souris

Biology

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Summary

Ce film et le protocole sont destinées à aider l'apprentissage du transfert nucléaire.

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Egli, D., Eggan, K. Nuclear Transfer into Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (1), e116, doi:10.3791/116 (2006).

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Abstract

Le transfert de noyau dans un ovocyte non fertilisé peut restaurer le potentiel de développement à une cellule différenciée. Cela démontre que le processus sous-jacents de développement, la différenciation et le vieillissement sont épigénétiques plutôt que les processus génétiques. La réversibilité de ces processus ouvre des perspectives passionnantes dans la recherche fondamentale, et dans un avenir plus lointain, dans la médecine régénérative. Chez la souris, les cellules souches embryonnaires peuvent être dérivées de cloner des embryons stade préimplantatoire. Ces cellules souches embryonnaires ont la capacité de donner naissance à tous les types cellulaires de l'organisme adulte. Fait important, ces cellules sont génétiquement identique au donneur. Si applicable aux humains, cela permettrait la dérivation de cellules souches d'un patient. Ces cellules pourraient alors être différenciés dans le type de cellules touchées du patient et étudié in vitro, ou utilisés pour remplacer les cellules endommagées ou manquantes. L'étude du transfert nucléaire chez la souris reste importante car elle peut nous informer sur les principes de la reprogrammation nucléaire. Ce film et le protocole d'accompagnement sont destinées à aider l'apprentissage du transfert nucléaire chez la souris, une méthode initialement développée dans le groupe du Prof Yanagimachi (Wakayama et al. 1998).

Protocol

Préparatifs:

  1. Une description détaillée de la superovulation et la culture d'embryons microgoutte peuvent être trouvés ailleurs 2.
  2. Préparez une boîte de Pétri avec des microgouttes de milieu de culture embryonnaire (par exemple KSOM, Chemicon). Couvrir avec de l'huile minérale (lots d'huile minérale doivent être testés pour la compatibilité avec la culture d'embryons). S'équilibrer à 37 ° C dans l'air, plus 5% de CO 2. (En 3110 Thermo-Electron chemise d'eau incubateur ou équivalent)
  3. Préparer un plat pour l'isolement d'ovocytes: gouttes Lieu de HEPES tamponné CZB & hyaluronidase (0,1% p / v, Sigma) dans une moitié de l'assiette et HCZB dans l'autre moitié. Couvrir avec de l'huile minérale. Gardez le plat au chaud sur une scène chauffée d'un microscope à dissection.
  4. Préparer le microscope: Placer une pipette tenue d'un diamètre extérieur d'environ 50 μ (légèrement plus petit que le diamètre de l'ovocyte) m, et une ouverture d'environ 20 m μ dans un porte-pipette. Pipettes Holding sont faciles à faire avec le matériel nécessaire, une aiguille (Sutter Instruments) et d'un extracteur microforge (Narishige), mais ils peuvent aussi être achetés à partir Humagen.

    Chargez le mercure 3-5 μ l dans la queue d'une micropipette (intérieur m de diamètre μ 8). Évitez les déversements de mercure. Préparer un plat avec plusieurs petites gouttes chacun de 11% p / v PVP (polyvinylpyrrolidone) dans HCZB et 5 μ g / ml de cytochalasine B HCZB. Utilisez le couvercle d'une boîte de Pétri, plutôt que le plat lui-même comme le couvercle a un rebord court qui n'interfère pas avec le mouvement de l'exploitation et les pipettes énucléation. Alignez les pipette de maintien et de la pipette d'énucléation une chute HCZB. Aspirer une HZCB peu dans la pointe de la pipette de maintien.
  5. Préparation de cellules du donneur dépend largement du type cellulaire et l'expérience de l'enquêteur envisage d'effectuer. En général, les cellules du donneur doivent être traités avec une enzyme protéolytique comme la trypsine et conservé sur la glace pour réduire la viscosité jusqu'au transfert.
  6. Euthanasier sans douleur souris 14-15 heures après l'administration d'hCG. Oviductes récolte et de les disséquer dans les eaux chaudes HCZB-hyaluronidase gouttes. Après environ. 5 min, les ovocytes seront pour la plupart libres de cellules du cumulus. Ils devraient ensuite être lavé plusieurs fois dans HCZB, puis lavés encore dans les gouttes KSOM pré-équilibrée, et conservés dans l'incubateur jusqu'à l'énucléation.

Énucléation

Les manipulations sont effectuées avec des micromanipulateurs hydrauliques, (Narishige) sur un microscope inversé, comme le Nikon TE200. Un micromanipulateur piézo (Primetech) est utilisé pour le forage de la zone pellucide. À bout plat énucléation et pipettes de transfert peuvent être achetés auprès Humagen. Nettoyer et lubrifier la pipette d'énucléation dans les gouttes PVP en expulsant gouttelettes microscopiques et le mercure en aspirant et en expulsant PVP. Pour éviter la viscosité de l'aiguille, la même procédure devrait être faite entre chaque groupe d'ovocytes énucléés qui sont soit ou transférés.

Placez un petit groupe d'ovocytes dans la goutte HCZB-cytochalasine B. La taille du groupe doit être adaptée au niveau de l'expérience de l'enquêteur. Les ovocytes ne doit pas être gardé sur la scène pendant plus de 20-30 min. Déplacer les instruments pour les gouttes HCZB-cytochalasine B. La pipette de maintien et de la pipette d'énucléation doit être mis en alignement avec le plan équatorial de l'ovocyte. Cela sera possible si la pipette de maintien a un diamètre extérieur qui est légèrement plus petit que l'ovocyte lui-même. Tournez un ovocyte jusqu'à la broche de la métaphase différente de réfraction peut être vu. Si un débutant ne peut pas voir la broche, la plaque métaphasique peuvent être identifiés en utilisant l'ADN colorant Hoechst et illumination UV, cependant, qui n'est pas compatible avec le développement embryonnaire efficace. Position de la broche métaphase à 3 heures et maintenez-le bien avec la pipette de maintien. Appliquer des impulsions piézoélectriques pour pénétrer la zone pellucide. Touchez la plaque métaphasique avec la pipette d'énucléation. Une fois la résistance de la broche métaphase peut être «ressentie», aspirer la broche et retirer l'aiguille. Le cytoplasme de l'ovocyte est fluide, la broche se déplace métaphase cependant comme un bouquet quand on le touche avec la pipette. Essayez de réduire la quantité de cytoplasme qui est enlevé avec de la broche. Après un groupe d'ovocytes a été énucléé, lavez-les à travers un milieu de culture embryonnaire et les placer dans l'incubateur jusqu'à ce transfert. Certains ovocytes énucléés ne devraient pas être transférés, mais doit être activé et servir de contrôle pour l'énucléation. Ces ovocytes seront fragment de quelques heures, indiquant une énucléation succès.

Transfert nucléaire

Placer dans les cellules PVP solution (11% de PVP dans HCZB). Si de nombreuses arrestations des clones à l'étape 1-cellule, la concentration en PVP devrait être abaissé à 5% ou moins. Mélangez bien les cellules d'esprith PVP. Ramassez les cellules avec une pipette avec un diamètre intérieur légèrement plus petit que le diamètre de la cellule. La membrane de la cellule se brise sur l'aspiration. Dans certains cas, l'expulsion et l'aspiration répétitifs ainsi que l'application d'impulsions piézo douce peut être utilisée pour briser la cellule donneuse. Une nouvelle baisse des cellules du donneur doivent être faites avec chaque groupe d'ovocytes en cours de transfert, comme les cellules du donneur deviennent collantes après un certain temps. Injecter la cellule donneuse rompu peu après la rupture de la membrane. Pour le transfert, se concentrer sur le plan équatorial de l'ovocyte lui-même plutôt que le plan équatorial de la zone pellucide, et la position du transfert et la pipette de maintien dans le même plan. Tenir l'ovocyte dont une partie de son cytoplasme fermement. Pénétrer la zone pellucide en utilisant des impulsions piézoélectriques. Apportez le noyau du donneur à l'extrémité de la pipette, puis poussez la pointe de la pipette presque à l'opposé de l'ovocyte énucléé, près de la pipette de maintien, ce qui rend un profond sillon dans l'ovocyte. Aspirer une très petite quantité de cytoplasme de l'ovocyte dans la pipette, appliquer une seule impulsion piezo faibles pour briser la membrane ovocytaire, éjectez le noyau du donneur, de retirer l'aiguille rapidement, tandis que l'aspiration à la membrane cytoplasmique à l'extrémité droite du sillon. En même temps retirer l'aiguille et l'aspiration, il devrait être possible de fermer le trou laissé par NT. Cette technique «trou retrait permettra de réduire le nombre d'ovocytes qui lysent cours NT. Lavez les ovocytes reconstruits dans KSOM et les retourner à l'incubateur pendant 1-3 heures.

L'activation des ovocytes

Préparer un demi d'un plat avec des gouttelettes de calcium MCZB libre et l'autre moitié avec des gouttelettes de calcium MCZB libre plus 10mM Sr 2 + et 5 μ g / ml à la cytochalasine B inhibe l'extrusion du globule polaire. S'équilibrer pendant 30 min. moins de 5% de CO 2 dans l'air. Lavez embryons NT ainsi en calcium sans MCZB puis placez-les en petits groupes dans différentes chutes de calcium sans MCZB. Retour le plat dans l'incubateur et la culture pendant 5-6 heures. Pour contrôler le protocole d'activation artificielle et pour les conditions de culture d'embryons, des ovocytes énucléés non doit être utilisé. Ils vont développer des embryons parthénogénétiques. Après activation, se laver les embryons travers embryons KSOM et les placer dans l'incubateur pour culture à long terme. Pronuclei devrait être visible à ce point dans le temps, indiquant le transfert réussi.

Culture embryon médias Cookbook

Sels de Maître

Commencer avec 980 ml ​​H 2 O ultrapure stérile en bouteille de 1 L

Ajouter des composants à sec:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405
MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1,18 mm) Sigma M-2773
KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2NA 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Le glucose (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Ajouter des composants liquides

Na-lactate (acide lactique) 5,3 ml & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 ml Gibco 15140-122

Pour les sels Stock MCZB:

Stériliser par filtration 500 ml sels de master (bon pour les 3-4 mois; conserver à 4 ° C)

Pour les sels Stock HCZB:

Commencez avec 500 ml sels de maître

Ajouter 50 mg de PVA (solubles à froid; Sigma P-8136)

Remuer pendant 30-60 min et filtre stérile (bon pour 3 mois; conserver à 4 ° C)

Ca + + libre MCZB (pour l'activation des ovocytes de 5% de CO 2)

Démarrer avec des sels ml 99 stocks MCZB

Ajouter des composants à sec:


NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761

Na-pyruvate (acide pyruvique) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamine 15mg Sigma G-8540

Albumine sérique bovine (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Swirl jusqu'à ce que tous les composants sont dissous; filtre stérile.

HCZB (pour la micromanipulation dans l'atmosphère ambiante)

Démarrer avec des sels ml 99 stocks HCZB

Ajouter des composants à sec:


Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761

Ajouter les composants liquides:

128 mM de CaCl 2 (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902

Ajuster le pH à 7,5 avec HCl 1 N

Agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile.

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Discussion

Bonne chance!

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Acknowledgments

DE tiens à remercier le Dr masquer Akutsu pour partager ses trucs NT et le Dr Stephen Sullivan et Garrett Birkhoff pour la lecture critique de ce protocole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cytochalastin B Sigma-Aldrich 100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride 10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts Start with 500 ml master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA Sigma-Aldrich P-8136 cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP ICN Biomedicals MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggan, K., Jaenisch, R. Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches. Pease, S., Lois, C. Springer. (2006).
  2. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the mouse embryo. Press, C. S. H. L. (2003).
  3. Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 394, 369-374 (1998).

Comments

6 Comments

  1. I am going to start ICSI in Equine (horese) oocyte and for this from start point I have some problems, in papers which I am going to follow they published that before injection they put 1 microlitter of sperm suspension in 3 microlitter of Sp-TALP containing 10% PVP (SIGMA) . I did the same, but you know 10% PVP (I calculated w/v) is to much powder that's why I found all of the sperm dead before injection. I don't know realy how I have to use this PVP (MW 360000) ?!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 5, 2008 - 8:07 AM
  2. Hello - I work at Sigma-Aldrich in St. Louis, Mo. and have received an answer for your question from our technical service group.  It follows below: _____________________________________________________________________________ We really do not have an answer as we do not have an IVF product. We do have the following references however we have not researched them. Some references on this product are as follows: 1. Yamazaki, Y., et al., Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100(²1),, 1²²07-1²²1² (²003). ². Shitara, H., et al., Selective and Continuous Elimination of Mitochondria Microinjected Into Mouse Eggs From Spermatids, but Not From Liver Cells, Occurs Throughout Embryogenesis. Genetics, 156, 1²77-1²84 (²000). 3. Coy, J.F., et al., A complex pattern of evolutionary conservation and alternative polyadenylation within the long 3'-untranslated region of the methyl-CpG-binding protein ² gene (MeCP²) suggests a regulatory role in gene expression. Human Mol. Genet., 8(7), 1²53-1²6² (1999). It is commonly used in Denharts solution at 1% (10mg/ml). For mouse embryo culture, PVP 40 (40,000 mw) is used at 0.5% in the culture media. The PVP360,000 solution is used to immobilize or slow the sperm. You may want to use a 1% solution rather than a 10% solution. _____________________________________________________________________________ We hope that the above is helpful to you. - Diane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 13, 2008 - 4:08 PM
  3. Do clones develop when injected into the body of the mother? ie not in the uterus? perhaps after a sufficient number of cell divisions, growth factors... has anyone tried? a little like conjointed twins. no be immune rejection if it dŒs, this could perhaps then allow to grow new members only, as happens often with conjointed twins. the new members would be fully young.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 29, 2008 - 6:00 PM
  4. terrific, and very instructive. Thanks a lot. Yunhai from China.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 25, 2008 - 3:40 AM


  5. Thanks a lot.

    YongWei from China.

    Reply
    Posted by: yongwei N.
    April 17, 2013 - 5:10 AM
  6. Hello,
    I'm a PhD student form Universitat Autònoma de Barcelona. The main tool of my studies is SCNT. I would like to contact with Dieter Egli and Kevin Eggan if it's possible, because i need some advices about the transfer of electrical impulse through the micropippete.
    Few months ago i used to use PVP 3% for cummulus cells, but i realised that PVP 10% was better for incresase the number of 2 cell embryos. Nowadays the problem is the transmition of piezzo. How much increases the PVP concentration, more difficult is the transmition of the electrical impulse across the micropippete. I've tried to increase the frequency, amplitude and duration of the electrical PiezoDrill, but at the moment is still too much difficult to breack the Zona pellucida.
    I'm sure that you will have some advices or an answer for this problem.
    Thank you.

    Reply
    Posted by: Laia P.
    December 22, 2014 - 1:27 PM

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