Large Volume (20L +) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

Biology

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Summary

Das Video dokumentiert großes Volumen (≥ 20 L) Filtration von mikrobieller Biomasse, die zwischen 0,22 &mgr; m und 2.7μm im Durchmesser, aus der Wassersäule.

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Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1161, doi:10.3791/1161 (2009).

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Abstract

Der Workflow beginnt mit der Sammlung von der Küste Meeresgewässer für nachgeschaltete mikrobielle Gemeinschaft, Nährstoff-und Spurengasen analysiert. Für dieses Verfahren wurden Proben aus dem Deck der HMS John Strickland, die in Saanich Inlet gesammelt. Das Video dokumentiert großes Volumen (≥ 20 L) Filtration von mikrobieller Biomasse, die zwischen 0,22 &mgr; m und 2.7μm im Durchmesser, aus der Wassersäule. Zwei 20L Proben können gleichzeitig gefiltert werden über ein einziges Aggregat mit vier rotierenden Köpfen ausgestattet. Die Filtration wird in das Feld, auf ausgedehnte Reisen gemacht, oder unmittelbar nach der Rückkehr für Tagesausflüge. Es ist wichtig, die Menge des Wassers, die durch jede Sterivex Filtereinheit aufnehmen. Um zu verhindern, Biofilmbildung zwischen Probenahme Reisen müssen alle Filteranlagen mit verdünnter HCl und VE-Wasser gespült werden und autoklaviert sofort nach Gebrauch. Dieser Vorgang dauert ca. 5 Stunden plus eine zusätzliche Stunde für aufzuräumen.

Protocol

  1. Set up des Filtrationsapparatur
    1. Zum Einrichten der Filtrationsvorrichtung, mit Hilfe einer Pinzette zu einem Grad GF / D-Filter in den Vorfilter Wohneinheit Platz. Locker ziehen Sie die Gehäuse von Hand. Als Faustregel gilt, nicht zu fest anziehen, oder das Gerät, sobald die Pumpen beginnt undicht.
    2. Ersetzen Sie den Glasballon Kappe mit dem autoklaviert Kappe und befestigt Schlauch durch vorsichtiges Einsetzen der inneren Schlauch in den Kanister ohne es zu berühren. Wenn nötig, mit Hilfe einer Pinzette, um den Schlauch in den Kanister zu führen.
    3. Führen Sie das externe Schlauch durch die Schlauchpumpe.
    4. Bringen Vorfilter Wohneinheiten bis zum Ende der beiden äußeren Rohre (dh 2 Einheiten pro Kanister). Ziehen Sie die Verbindung mit einer Zange.
  2. Filtration von Meerwasser
    1. Um die Filterung des Meerwassers, auf die Pumpe einschalten und die Strömungsgeschwindigkeit zu 1. Sehen Sie, um sicherzustellen, dass das Wasser wird in die richtige Richtung gepumpt.
    2. Lassen Sie 500 ml Wasser frei fließen durch den Vorfilter-Einheit und in einem 1 L Becherglas.
    3. Schalten Sie die Pumpe und befestigen Sie eine Sterivex Filter auf den männlichen Luer-Anschluss an das freie Ende des Vorfilter-Setup. Ziehen Sie die Vorfiltergehäuse eng mit der Hand.
    4. Achten Sie bei der Vorfilter Gehäuse und an der Verbindung zwischen dem Vorfilter Gehäuse und die Schläuche, die den Ballon führt. Wenn Undichtigkeiten auftreten, schalten Sie die Pumpe aus und lösen Sie und ziehen Sie die Vorfiltergehäuse entsprechend. Schalten Sie die Pumpe wieder ein.
    5. Das Filtrat in 4 L Flaschen. Sobald sie voll sind, leeren Sie den Kolben in ein sauberes Glasballon. Achten Sie darauf, die Lautstärke durch jeden Filter geleitet beachten. Gesammelte Filtrat weiter verarbeitet werden kann, wie Filtration auf Viren.
    6. Weiter Filterung, bis kein Wasser in die Ballons übrig bleibt. Usual Filtrationszeiten Bereich zwischen 4-5 h / 20 L Kanister, allerdings hängt dies stark von der Menge der Biomasse im Wasser.
    7. Nach Filtration beendet ist, schalten Sie die Pumpe aus und trennen Sie das Sterivex Filter.
  3. Lagerung von Filtern
    1. So speichern Sie die Filter, zuerst zu vertreiben restliche Wasser mit einem 30-60 ml Spritze.
    2. Mit einer Pipette 1,8 ml Lysepuffer, um den Filter, halten ~ 200 ul des Raumes in den Filter für die spätere Zugabe von Reagenzien.
    3. Verschließen Sie die untere und obere der Sterivex Filter mit einem kleinen Stück Parafilm, und beschriften Sie die Filter mit dem Datum und Identifizierung der Proben.
    4. Bewahren Sie die Filter in einer pre-markierten 50 ml Falcon-Röhrchen bei -80 ° C
    5. Entfernen Sie die Filter aus dem Gehäuse, und setzen Sie sie in beschriftete 50 ml Falcon-Röhrchen mit 2 ml Lysepuffer. Bewahren Sie diese bei -80 ° C.
  4. Cleanup
    1. Für die endgültige Bereinigung, platzieren Sie den Schlauch im Inneren des Ballons wurde in einen Kolben mit 0,1 M HCl
    2. Richten Sie die Schläuche, die zum 4L Kolben in die ursprüngliche Glasballon führen.
    3. Schalten Sie die Pumpe und laufen bei 3, das Sammeln der Durchfluss durch laufen in der ursprünglichen Glasballon.
    4. Schließlich spülen Sie den Schlauch mit Wasser autoklaviert.

Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis besteht aus zwei Sterivix Filter jeweils mikrobiellen Biomasse von etwa 10 L Meerwasser in der Größenordnung von 0,22 &mgr; m und 2.7μm. Dies ist in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Darüber hinaus sammelt dieses Verfahren und konzentriert Biomasse größer als 2,7 um, auf der GF / D Vorfilter. Dies ist auch in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Wenn zusätzliche Verarbeitungsschritte übernommen werden, kann der 0,22 &mgr; M Flow-Through nach unten konzentriert werden, um das virale Fraktion sowie zu sammeln.

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Discussion

Es ist zwingend notwendig, um abwischen Bänke und Pumpen mit einem feuchten Tuch nach dem Gebrauch an alle verbliebenen Spuren von Salzwasser, die sonst korrodieren würden Geräte zu entfernen. Obwohl das Verfahren ist einfach, kann der Zeitbedarf werden umfangreiche abhängig von der Konzentration der Biomasse oder Verunreinigungen in der Probe herausgefiltert.

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Acknowledgments

Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. DAW wurde durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer Reagent 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl Reagent For post-filtration rinse
Autoclaved water Reagent For post-filtration rinse

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Comments

4 Comments

  1. Cool way to show off filtration protocols! Do your pre-filters ever clog?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 12:56 AM
  2. Hi Ian, We never have problems with pre-filter clogs but if microbial biomass is high, we do need to switch up the filters often.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 19, 2009 - 2:39 PM
  3. How much dŒs the filtration apparatus cost?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 1, 2009 - 4:46 AM
  4. For you is for free

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 18, 2011 - 4:45 PM

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