Small Volume (1-3L) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Das Video dokumentiert kleines Volumen (~ 1 L) Filtration von mikrobieller Biomasse aus der Wassersäule.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Small Volume (1-3L) Filtration of Coastal Seawater Samples. J. Vis. Exp. (28), e1163, doi:10.3791/1163 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Der Workflow beginnt mit der Sammlung von der Küste Meeresgewässer für nachgeschaltete mikrobielle Gemeinschaft, Nährstoff-und Spurengasen analysiert. Für heute s Demonstration Proben wurden vom Deck der HMS John Strickland, die in Saanich Inlet gesammelt. Das Video dokumentiert kleines Volumen (~ 1 L) Filtration von mikrobieller Biomasse aus der Wassersäule. Das Protokoll ist eine Erweiterung des großen Volumens Probenahmeprotokoll oben beschrieben, mit einem wichtigen Unterschied: hier gibt es keine Pre-Filtration, so dass alle Größenklassen von Biomasse bis zum 0,22 um Filter-Cutoff gesammelt werden. Proben, die auf diese Weise sind ideal für Nukleinsäure-Analyse. Das Set-up-, Filtrations-und clean-up Schritte jeweils ca. 20-30 Minuten in Anspruch nehmen. Bei Verwendung von zwei Schlauchpumpen gleichzeitig bis zu 8 Proben gleichzeitig gefiltert werden. Um zu verhindern, Biofilmbildung zwischen Probenahme Reisen müssen alle Filteranlagen mit verdünnter HCl und VE-Wasser gespült werden und autoklaviert sofort nach Gebrauch.

Protocol

  1. Set up des Filtrationsapparatur
    1. Vor dem Filtrieren, zuerst abwischen Kondensation aus der vollen Flaschen und wägen
    2. Ein Autoklav bin auf der einen Seite der Pumpe, und die Abfälle Kolben auf der anderen.
    3. Dann legen Sie eine volle Probenflasche in den Autoklaven bin, aber nicht entfernen Sie die Kappe der Flasche noch.
    4. Pass den Schlauch durch die Schlauchpumpe, so dass die Luer-Ende des Schlauchs wird in den Kolben.
    5. Mit einer Pinzette entfernen Sie die Baumwolle aus einem sterilen 25 ml Pipette, und befestigen Sie die Pipette an das andere Ende des Schlauchs.
  2. Filtration von Meerwasser
    1. Um die Filterung Meerwasser, öffnen Sie die Flasche und legen Sie die Pipette. Schalten Sie die Pumpe und stellen Sie die Fließgeschwindigkeit auf 1. Sehen Sie, um sicherzustellen, dass das Wasser wird in die richtige Richtung gepumpt.
    2. Lassen Sie ~ 100 ml Wasser, um durch den gesamten Schlauch passieren.
    3. Schalten Sie die Pumpe und befestigen Sie eine Sterivex Filter auf den männlichen Luer-Anschluss an das freie Ende des Schlauchs.
    4. Weiter Filterung, bis kein Wasser in den Flaschen übrig bleibt.
  3. Lagerung von Filtern
    1. So speichern Sie die Filter, zuerst zu vertreiben restliche Wasser mit einem 30-60 ml Spritze.
    2. Seal der Unterseite des Sterivex Filter mit Parafilm. Mit einer Pipette 1,8 ml Lysepuffer, um den Filter, halten ~ 200 ul des Raumes in den Filter für die spätere Zugabe von Reagenzien.
    3. Dann Siegel der Spitze der Sterivex Filter mit einem kleinen Stück Parafilm, und beschriften Sie die Filter mit dem Datum und Identifizierung der Proben.
    4. Bewahren Sie die Filter in pre-markierten 50 ml Falcon-Röhrchen bei -80 ° C
  4. Aufräumen
    1. Legen Sie die 25 ml Pipette in einen Kolben mit 0,1% HCl, und schalten Sie die Pumpe.
    2. Nach dem HCl waschen, spülen Sie den Schlauch mit Wasser autoklaviert.

      Schließlich messen und notieren Sie die Masse der jetzt leer 1L, um das Volumen des Wassers durch den Filter geleitet zu berechnen.

Repräsentative Ergebnisse: Stück 1 L Wasserprobe resultiert in einem Sterivix Filter, der Biomasse größer als 0,22 um enthält. Dies ist in Lysepuffer für spätere DNA-Extraktion und Analyse gespeichert. Das Endergebnis besteht aus einem Sterivix Filter pro 1-Liter-Flasche in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Der Filter enthält Biomasse größer als 0,22 um. Filter können bei -80 ° C vor der EDNA-Extraktion gelagert werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Es ist zwingend notwendig, um abwischen Bänke und Pumpen mit einem feuchten Tuch nach dem Gebrauch an alle verbliebenen Spuren von Salzwasser, die sonst korrodieren würden Geräte zu entfernen. Obwohl das Verfahren ist einfach, kann der Zeitbedarf werden umfangreiche abhängig von der Konzentration der Biomasse oder Verunreinigungen in der Probe herausgefiltert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. DAW wurde durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Peristaltic pump Masterflex (Cole Palmer) 77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing Masterflex (Cole Palmer) 06429-24 For filtration apparatus
Hose clamps Cole-Parmer 0683204 For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors Cole-Parmer 31702-20 For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing ADVANTEC 501200 For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock) Cole-Parmer 31507-27 For filtration apparatus
2“ Magnets For filtration apparatus
3 port carboy caps For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters EMD Millipore SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters Whatman, GE Healthcare 1823047
Lysis buffer 0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl For post-filtration rinse
Autoclaved water For post-filtration rinse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Comments

2 Comments

  1. I'm interested about the video but unfortunately our school dŒs not have subscription for the JoVE. Is there any other way I can access the video?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 11, 2011 - 10:23 PM
  2. Dear Stephen, Please contact me at ward.parry@jove.com so that I can discuss your request with you. Best wishes,
    Ward Parry

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 12, 2011 - 4:46 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics