قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

Published 11/30/2006
4 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

يمكن أن القدرة على قياس حركية الافراج حويصلة تساعد على توفير نظرة ثاقبة بعض أساسيات العصبي. المستخدمة هنا فإننا في الوقت الحقيقي التصوير من الحويصلات المسمى مع وزير الخارجية صبغ أحمر فلوري 4-64 لقياس معدل الافراج قبل المشبكي حويصلة في الثقافات العصبية الحصين.

Cite this Article

Copy Citation

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يمكن أن القدرة على قياس حركية الافراج حويصلة تساعد على توفير نظرة ثاقبة بعض أساسيات العصبي. المستخدمة هنا فإننا في الوقت الحقيقي التصوير من الحويصلات المسمى مع صبغة FM لرصد معدل الافراج قبل المشبكي حويصلة. FM4 - 64 هو صبغ أحمر فلوري amphiphilic styryl أن يضمن في أغشية الحويصلات متشابك كما هو حفز الإلتقام. التفاعلات محبة للدهون يؤدي إلى زيادة صبغ كثيرا في مضان مما يؤدي إلى انبعاث إشارة ساطعة عندما يرتبط مع حويصلات واحد عندما الاسمية في السائل خارج الخلية. يستخدم بعد خطوة للمساعدة على إزالة غسل الصبغة الخارجية داخل غشاء البلازما ، ويتركز وزير الخارجية المتبقية داخل الحويصلات وطرد بعد ذلك عندما يتم بفعل إيماس جولة أخرى من التحفيز الكهربائي. يقاس معدل الإفراج الحويصلات الناتجة عن انخفاض في مضان. منذ يمكن تطبيقها FM الصبغة الخارجية وعابر ، بل هو أداة مفيدة لتحديد معدلات إيماس الثقافات في الخلايا العصبية ، وخصوصا عندما تقارن بين معدلات ونقاط الاشتباك العصبي transfected حبات السيطرة المجاورة.

Protocol

الخلايا : الجرذ (أو الماوس) الابتدائي الثقافات العصبية قرن آمون (14-28 يوما في المختبر).

تنبيه : الكهربائية ، وتسليمها عبر أقطاب البلاتين اثنين ؛ 70-90 بالسيارات

المجهري : 60x عدسة المجهر النفط على اتفاقية مكافحة التصحر مقلوب الفلورسنت.

البرنامج : Slidebook (التصوير الذكي الابتكارات ، وسانتا مونيكا ، كاليفورنيا)

انظر الصفحة أساليب تكميلية لمزيد من التفاصيل

  1. الحارة HEPES - مخزنة المالحة (HBS) إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة الغلوتامات مضادات مستقبلات APV (50 ميكرومتر تركيز النهائي) وCNQX (10 ميكرومتر النهائي). كل تجربة FM يتطلب عادة 20-30 مل HBS. تركيز للعمل من 10 ميكرومتر FM 4-64 (المسابر الجزيئية) ، تمييع الحل في الأسهم 1:1000 HBS (مع الخصوم المضافة). 2 مل جعل FM soln لكل تجربة. الحل مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء.

  2. تحميل ساترة تحتوي على الخلايا العصبية على الغرفة الكهربائي. تأكد من أن وسائل الإعلام في الغرفة مع مستوى أعلى من غرفة ويغطي تماما الأقطاب. إزالة أي حل الزائدة من أسفل ساترة. إضافة إلى النفط العدسة (اذا كنت تستخدم عدسة النفط).

  3. إعداد جهاز نضح. شطف الأولى مع قليل من كل مل بعد بالترتيب معينة (يسمح لكل موضوعي ودقيق قبل إضافة المقبل) : الماء ، والإيثانول ، والمياه ، ثم HBS. إضافة المقبل HBS (حفظ مل قليلة لإضافة باليد في الخطوات المستقبلية) وإغلاق الارواء. إعداد منفذ نضح والشفط على طرفي نقيض في حواف ساترة. فمن الأفضل إذا كان منفذ نضح تصل الى غرفة ، حيث كما يجب أن يبني الشفط في أعلى جدا. في حين اضاف HBS (إما عن طريق رذاذ أو باليد) ، افتح الشفط وتعديل موقفها بحيث يحافظ على وسائل الإعلام على مستوى الحق فقط تغطي تماما الأقطاب.

  4. ابحث عن منطقة تقع على ساترة كنت ترغب في صورة ومحاولة جمع ما يقرب من ذلك في التركيز. المناطق المثلى تحتوي المشابك كثيرة ، ولكن لا ينبغي أن يكون كثيفا جدا بحيث تصبح العمليات الفردية تمييزه. وينبغي أن يكون هناك أي إلى الحد الأدنى من أجسام الخلايا والأغشية غريبة (مثل كتل من الخلايا النجمية) ، أو مواد غير محددة أخرى (مثل الوبر). قد صبغ FM التقيد بهذه nonspecifically.

  5. استخدام "مجموعة العمل" المكعب تصفية (الذي يثير مع ضوء أخضر وأحمر يجمع إلى أبعد من انبعاثات الحمراء). تعيين "تفضيلات التقاط" Slideview لتسليم 900 AP في 10Hz عند ظهور صورة (تستخدم عادة 300-900 نقاط وصول لهذا التحفيز التحميل) 0. في إطار الصورة ، وحدد "fluo - VIS الحمراء" ضبط الوقت وتغيير فلتر التعرض إلى 100 مللي ثانية. إيقاف أية إعدادات timelapse موجودة من قبل. لا تأخذ أي صور حتى تكون على استعداد لبدء التحفيز.

  6. تأكد من الشفط على / فتح. إضافة بسرعة soln FM (2 مل) إلى غرفة في الطرف المقابل من الشفط. اضغط على الفور ما يرام في إطار الصورة لالتقاط صورة ويبدأ التشويق. انتظر 30-45 ثانية بعد التحفيز ثم يغسل بسرعة FM بإضافة ~ 2 مل من HBS (أفعل ذلك من خلال جنب مع ماصة ، ولكن يمكن أيضا أن يتم ذلك بواسطة التروية).

  7. غسل FM مع HBS عبر نضح لمدة 10 دقائق ~. وينبغي أن يكون معدل تدفق 1-1،5 مل / دقيقة. أثناء هذه الخطوة غسل تغيير تفضيلات التحفيز بحيث يبدأ ظهور التحفيز @ صورة 10 (تستخدم عادة 900-1200 نقاط وصول @ 10 هرتز لهذا التحفيز destaining). حوالي 7 دقائق في الغسيل ، وتحقق مضاعفة التفضيلات (بداية من الحوافز في صورة 10). تستخدم الآن في إطار التركيز الصغيرة اختيار وتركيز دون الإقليمية. تأكد بأنه قد تم تغيير إعدادات التنبيه قبل الشروع في الخطوة التالية. التقاط صورة واحدة لمعرفة ما اذا كانت تغسل كاملة (وينبغي أن نقاط الاشتباك العصبي punctated الفردية بشكل واضح). إن لم يكن ، وزيادة معدل تدفق an 0.5mL/min إضافية ، وانتظر دقيقة أخرى 2.

  8. يغسل مرة واحدة كاملة ، وضبط الوقت والتعرض اللازمة لاستقبال ما زالت جيدة ، إشارة واضحة (وعادة ما بين 5-10 مرات. التعرض مللي ينبغي التقليل بسبب photobleaching السريع للFM). ثم تعيين تفضيلات timelapse على اتخاذ الصور 38 كل 5 ثوان. التحقق من نضح لجعل هناك ما يكفي من HBS لمدة 5 دقائق ، ومغادرة نضح المتدفقة. بدء timelapse لبدء destaining.

  9. بعد يزيل اللون ، أو تغيير إعدادات التحفيز لتقديم AP 1200 @ 10Hz (1200-2000 عادة تستخدم نقاط وصول لهذه الخطوة النهائية) على صورة 0. إيقاف الإعدادات timelapse واتخاذ صورة واحدة لبدء التحفيز. يجب أن تكون لا تزال تتدفق نضح هذه الخطوة سوف تساعد على إزالة أي صبغة المتبقية FM الحويصلي ، من أجل تحديد خط الأساس / "مجموع نشره" مضان. بعد الانتهاء من التحفيز ، إيقاف الإعدادات التحفيز ، وجعل المنطقة في التركيز. إغلاق نضح والشفطوبعد ذلك يأخذ صورتين الأساس النهائي. يمكن اتخاذها سواء لوحات واحد أو Z - كومة صور (0.5 ميكرومتر الخطوات). Z - المداخن هي مفيدة في حال كان هناك تحول في الطائرة من التركيز أثناء التجربة.

  10. يتم تجربتك FM. إذا كان القيام على الفور المزيد من التجارب ، يجب تنظيف العدسة وبين كل غرفة المحاكمة ، ولكن جهاز نضح لا يلزم أن يكون تنظيفها حتى بعد التجربة النهائية. شطف الجهاز بالكامل مع الماء ، ثم الايثانول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وإمكانات العمل 300 (APS) كافية لإحداث ما لا يقل عن جولة واحدة من إعادة تدوير الحويصلة ، حافزا التحميل من 300 نقاط وصول ، أو تعطى غالبا ما تكون أكثر لتسمية تجمع تدوير الحويصلات. على الرغم من المحفزات تحميل أكثر كثافة ، مثل 900 كالة الأنباء الجزائرية ، قد تسمح لعدد رمزي من الحويصلات إضافية ليكون المسمى ، وهذا يزيد أيضا من مقدار الوقت الصبغة يمكن تضمينها في الأغشية خارج الخلية ، مما يؤدي إلى مزيد من تلطيخ غير محددة. لقد وجدت هذه الخطوة ستكون حاسمة لغسل لضمان destaining المناسبة. من المهم أن يروي مع معدل التدفق 1-1،5 مل في الدقيقة الواحدة ، وعادة لمدة 10 + 2 دقيقة. ويمكن اتخاذ صورة واحدة ~ 7 دقائق من بداية غسل لرصد مدى إزالة الصبغة. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يكون معدل التدفق أو الوقت ويغسل زيادة طفيفة. لتجاربنا كان غير مرغوب فيه ليغسل والمضي قدما أكبر من 10-12 دقيقة لأن هذا يزيد من احتمال فقدان حويصلة وضع العلامات من خلال الأحداث إيماس العفوية التي قد تحدث حتى عندما تكون الخلية في حالة راحة. للخطوة destaining ، كانت تدار 900-1200 نقاط وصول إلى الإفراج عن جميع الحويصلات المسمى. بالإضافة إلى ذلك قدمت في كثير من الأحيان نقاط وصول أخرى 1200-2000 إلى الحصول على قيمة أساسية من "مضان نشره" ، وتستخدم لتطبيع البيانات destaining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats