מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית ​​יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית ​​שכותרתו עם FM לצבוע כדי לפקח על קצב שחרור שלפוחית ​​presynaptic. FM4-64 הוא צבע אדום ניאון styryl amphiphilic כי מטביע לתוך הממברנות של שלפוחית ​​סינפטית כמו אנדוציטוזה מגורה. אינטראקציות lipophilic לגרום לצבוע כדי להגדיל באופן משמעותי בשנת הקרינה, ולכן פולטות אות בהיר כאשר הקשורות שלפוחית ​​ואחד הנומינלי כאשר בנוזל תאיים. אחרי צעד לשטוף משמש כדי לסייע להסיר צבע חיצוני בתוך קרום התא, FM הנותרים מרוכזת בתוך שלפוחית ​​והוא גורש מכן, כאשר exocytosis הוא המושרה על ידי סיבוב נוסף של גירוי חשמלי. קצב שחרור שלפוחיות נמדדת מירידה וכתוצאה מכך הקרינה. מאז FM צבע ניתן ליישם חיצוניים transiently, הוא כלי שימושי לקביעת שיעורי exocytosis בתרבויות העצבית, במיוחד כאשר משווים את שיעורי בין הסינפסות transfected ו boutons לשלוט השכנות.

Protocol

תאים: חולדה (או עכבר) העיקרי בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס (14-28 ימים במבחנה).

גירוי: חשמל, מועבר דרך שתי אלקטרודות פלטינה: 70-90 mV

מיקרוסקופית: 60x עדשה שמן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי CCD הפוכה.

תוכנה: Slidebook (Intelligent הדמיה חידושים, סנטה מוניקה, CA)

ראה עמוד משלים שיטות לפרטים נוספים

  1. חם HEPES שנאגרו מלוחים (בהרוורד) לטמפרטורת החדר. מוסיפים את היריבים קולטן הגלוטמט APV (50 מיקרומטר ריכוז סופי) ו CNQX (10 מיקרומטר הסופי). כל ניסוי FM בדרך כלל דורש 20-30 מ"ל בהרוורד. עבור עובד ריכוז של 10 מיקרומטר FM 4-64 (בדיקות מולקולריות), לדלל פתרון מניות 1:1000 ב בהרוורד (עם היריבים הוספה). בצע 2 מ"ל FM soln עבור כל ניסוי. מכסים ברדיד פתרון כדי למנוע חשיפה לאור.

  2. הר coverslip המכיל את הנוירונים על החדר אלקטרודה. בדוק כי התקשורת בתא היא רמת עם גבי קאמרית מכסה לחלוטין את האלקטרודות. הסר את כל פתרון העולה מתחתית coverslip. הוספת שמן על העדשה (אם באמצעות עדשה שמן).

  3. הגדרת מנגנון זלוף. לשטוף מ"ל כמה מאלה כל סדר נתון (שלא כל זרימה one ביסודיות לפני הוספת הבא): מים, מים, אתנול, אז בהרוורד. לאחר מכן להוסיף את בהרוורד (לשמור כמה מ"ל להוסיף ביד בצעדים בעתיד) ולסגור את זלוף. הגדרת מוצא זלוף ואת יניקה משני צדי המתרס בשולי coverslip. זה הכי טוב אם את שקע זלוף מגיע אל החדר, שם כמו יניקה צריך לנוח בחלקו העליון. בעוד הוספת בהרוורד (או על ידי זלוף או ביד), לפתוח את היניקה ולהתאים את עמדתה, כך טוען בתקשורת על זכות ברמה פשוט מלא מכסה את האלקטרודות.

  4. חפש באזור על coverslip שברצונך התמונה ולנסות להביא אותו בערך בפוקוס. אזורים אופטימלית מכילים סינפסות רבות, אבל לא צריך להיות כל כך צפוף כזה תהליכים בודדים ניתן יהיה להבחין בינן. לא צריך להיות שום ל-מינימלית גופי התא, קרום חיצוני (כגון גושים של האסטרוציטים), או חומרים לא ספציפיים אחרים (כגון מוך). לצבוע FM עשוי nonspecifically לדבוק אלה.

  5. השתמש "WG" קוביה המסנן (אשר מלהיב עם אור ירוק אדום ואוסף ל-הרבה פליטות אדום). הגדר Slideview "העדפות ללכוד" כדי לספק 900 AP ב 10Hz על תחילתה של תמונה 0 (בדרך כלל 300-900-APS משמשים גירוי זה טעינה). בחלון התמונה, בחר את "fluo מול אדום" הגדרות המסנן ולשנות זמן חשיפה 100 ms. בטל קיימים הגדרות timelapse. אל תיקח את כל התמונות עד שתהיה מוכן להתחיל את הגירוי.

  6. ודא יניקה הוא על / פתוח. מהר להוסיף את soln FM (2 מ"ל) לחדר בקצה השני של יניקה. מיד העיתונות בסדר בחלון התמונה לקחת תמונה להתחיל גירוי. חכו 30-45 שניות לאחר גירוי ואז לשטוף במהירות FM ידי הוספת ~ 2 מ"ל של בהרוורד (אני עושה זאת ביד עם טפטפת, אבל זה יכול להיעשות גם על ידי זלוף).

  7. שטפו את FM עם בהרוורד דרך זלוף עבור ~ 10 דקות. קצב הזרימה צריך להיות 1-1.5 mL / min. במהלך שלב זה לשטוף, לשנות את העדפות גירוי כך את הופעת גירוי מתחיל @ תמונה 10 (בדרך כלל 900-1200 APS @ 10 Hz משמשים גירוי זה destaining). כ 7 דקות לתוך לשטוף, בדוק את ההעדפות (הופעת גירוי על תמונה 10). עכשיו באמצעות חלון קטן להתמקד לבחור ולהתמקד subregion. ודא את הגדרות גירוי שונו לפני שתמשיך לשלב הבא. קחו תמונה אחת כדי לראות אם לשטוף תושלם (סינפסות הפרט צריך להיות punctated בבירור). אם לא, להגביר את קצב זרימת 0.5mL/min נוספים, לחכות עוד 2 דקות.

  8. לאחר לשטוף תושלם, להתאים את זמן החשיפה הדרוש כדי עדיין לקבל אות טוב, ברור (בדרך כלל בין 5-10 מילישניות. חשיפה פעמים צריך להיות ממוזער בשל photobleaching מהירה של FM). ואז להגדיר את ההעדפות timelapse לקחת 38 תמונות כל 5 שניות. בדוק את זלוף לעשות יש מספיק בהרוורד עוד 5 דקות, ולהשאיר זלוף זורם. התחל timelapse להתחיל destaining.

  9. לאחר destain, לשנות את ההגדרות כדי לספק גירוי 1200 AP @ 10Hz (בדרך כלל 1200-2000-APS משמשים בשלב זה סופי) על התמונה 0. כבה את הגדרות timelapse ולקחת תמונה אחת כדי להתחיל גירוי. זלוף עדיין צריך להיות זורם צעד זה יסייע להסיר כל צבע שלפוחי הנותרים FM, על מנת לקבוע הבסיס / "הכל releasable" פלואורסצנטי. לאחר הגירוי הוא סיים, לכבות את הגדרות גירוי, להביא את האזור להתמקד. סגור את זלוף ו יניקהולאחר מכן לקחת שתי תמונות הבסיס הסופי. או תמונות בודדות או Z-מחסנית תמונות (0.5 צעדים מיקרומטר) ניתן לקחת. Z-ערימות מועילים במקרה לא היה שינוי המטוס של המוקד במהלך הניסוי.

  10. הניסוי FM שלך נעשה. אם מיד עושים ניסויים יותר, העדשה קאמרית יש לנקות בין כל ניסוי, אך המנגנון זלוף לא צריך לנקות עד לאחר הניסוי הסופי. שוטפים את מנגנון לחלוטין עם מים, אז אתנול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי 300 הפוטנציאלים לפעולה (APS) מספיקה כדי לגרום לפחות סיבוב אחד של מיחזור שלפוחית, גירוי הטעינה של 300 APS או יותר ניתנת לעיתים קרובות התווית בריכה מיחזור של שלפוחית. למרות גירויים טעינת אינטנסיבי יותר, כגון APS 900, עשוי לאפשר מספר נקוב של שלפוחית ​​נוספת כדי להיות מתויג, זה גם מעלה את כמות הזמן לצבוע יכולים להטביע ממברנות תאי, המוביל מכתים הלא ספציפית יותר. מצאתי את הצעד לשטוף להיות קריטית כדי להבטיח destaining הנכון. חשוב perfuse עם קצב זרימה 1-1.5 מ"ל לדקה, בדרך כלל 10 + 2 דקות. תמונה אחת שניתן לנקוט ~ 7 דקות לתוך לשטוף את לנטר את מידת הסרת צבע. אם יש צורך, קצב זרימת הזמן או לשטוף ניתן להגדיל מעט. על הניסויים שלנו זה היה בלתי רצויות עבור לשטוף את להמשיך יותר מ 10-12 דקות כמו זה מגדיל את הסבירות של אובדן שלפוחית ​​תיוג דרך אירועים exocytosis ספונטנית אשר עלולה להתרחש גם כאשר התא נמצא במנוחה. עבור השלב destaining, 900-1200 APS ניתנו לשחרר את כל שלפוחית ​​שכותרתו. בנוסף APS אחר 1200-2000 ניתנו לעתים קרובות כדי להשיג ערך הבסיסית של "הקרינה releasable", המשמש לנרמל את הנתונים destaining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics