Измерение экзоцитоза в Нейроны Использование FM-маркировки

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены красным флуоресцентным красителем FM 4-64 для измерения скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков в гиппокампе нейронов культур.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Возможность измерения кинетики пузырьков релиз может помочь дать представление о некоторых основах нейротрансмиссии. Здесь мы использовали в режиме реального времени изображения пузырьков помечены FM краситель для контроля скорости пресинаптическое высвобождение пузырьков. FM4-64 представляет собой красный флуоресцентный амфифильных стирил краситель, который встраивается в мембраны синаптических пузырьков как эндоцитоза стимулируется. Липофильные взаимодействия причиной красителя значительно увеличить флуоресценции, таким образом, излучающие яркий сигнал, когда связанные с пузырьками и номинальной, когда во внеклеточной жидкости. После мытья шаг используется, чтобы помочь устранить внешние красителя в плазме мембраны, оставшиеся FM сосредоточен в пузырьках, а затем изгнали когда экзоцитоза индуцирована очередной раунд электрической стимуляции. Скорость выделения пузырьков измеряется от последующем снижении флуоресценции. С FM красителя может быть применено внешнее и скоротечно, это полезный инструмент для установления ставок экзоцитоз в нейрональных культурах, особенно при сравнении ставок между трансфицированных синапсов и соседних boutons контроля.

Protocol

Клетки: Крыса (или мыши) первичных нейронов гиппокампа культур (14-28 дней в пробирке).

Стимуляция: Электрическое, доставляется через двумя платиновыми электродами; 70-90 мВ

Микроскопия: 60x объектив нефти на перевернутую ПЗС-флуоресцентного микроскопа.

Программное обеспечение: Slidebook (Intelligent изображений Инновации, Санта-Моника, Калифорния)

Смотрите дополнительную страницу методы подробности

  1. Теплый HEPES-солевой буфер (ОБД) до комнатной температуры. Добавить глютамат рецепторов APV (50 мкМ конечной концентрации) и CNQX (10 мкМ финал). Каждый FM эксперимент как правило, требует 20-30 мл HBS. Для работы в концентрации 10 мкМ FM 4-64 (Molecular Probes), разбавить исходный раствор 1:1000 в HBS (с антагонистами добавлено). Сделайте 2 мл FM soln для каждого эксперимента. Обложка решение с фольгой, чтобы предотвратить воздействие света.

  2. Горы покровное содержащих нейронов на электрод камеры. Убедитесь, что носитель в камере на одном уровне с верхней части камеры и полностью покрывает электродов. Удалите излишки раствора из нижней части покровное. Добавьте масло, чтобы линзы (при использовании масла линзы).

  3. Настройка перфузии аппарата. Вначале промыть несколько мл каждого следующего в определенном порядке (пусть каждый поток тщательно прежде, чем добавить следующее): вода, этиловый спирт, воду, затем HBS. Затем добавьте HBS (за исключением нескольких мл добавить вручную в будущих шагов) и закройте перфузии. Настройка выхода перфузии и всасывания на противоположных сторонах по краям покровного стекла. Лучше всего, если перфузии выходе достигает в камеру, где, как всасывания должна лежать на самом верху. При добавлении HBS (либо перфузии или вручную), открытой всасывающей и корректировать свою позицию, с тем, что он поддерживает средства массовой информации на должном уровне, только полностью покрывают электроды.

  4. Ищите области на покровное вы хотите изображения и попытаться грубо привести его в фокусе. Оптимальные области содержат много синапсов, но не должна быть настолько плотной, что отдельные процессы становятся неразличимыми. Там не должно быть до минимально органов клетки, посторонние мембран (например, скопления астроцитов), или другие неспецифические материалов (таких как нибудь вкусненькое). Красителя FM могут неспецифически придерживаться этих.

  5. Используйте "РГ" фильтр куб (который возбуждает зеленым светом и собирает красно-дальнего красного выбросов). Установить SlideView "захвата предпочтений", чтобы поставить 900 AP, от 10 Гц при наступлении образ 0 (обычно от 300 до 900 точек доступа используется для загрузки этого стимула). В окне изображения, выберите "флуоресцентных-VIS-красный" настройки фильтра и изменения времени экспозиции до 100 мс. Выключите все уже существующие настройки timelapse. Не следует принимать какие-либо изображения, пока вы готовы приступить к стимуляции.

  6. Убедитесь, что на всасывание / открыть. Быстрое добавление FM soln (2 мл) в камере на противоположной стороне всасывания. Немедленно нажмите хорошо в окне изображения, чтобы принять образ и начать стимуляцию. Подождите 30-45 сек после стимуляции, а затем быстро промыть FM, добавив ~ 2 мл HBS (я делаю это вручную с помощью пипетки, но это также может быть сделано путем перфузии).

  7. Вымойте FM с помощью ОБД перфузии в течение ~ 10 минут. Скорость потока должна быть 1-1,5 мл / мин. В течение этого мыть шаг, изменение предпочтений стимуляции, так что начало стимуляции начинается @ изображение 10 (обычно от 900 до 1200 точек при 10 Гц используются для этого destaining стимула). Около 7 минут на мытье, дважды проверьте настройки (начало стимула на изображение 10). Теперь, используя небольшое окно фокус выбрать и сосредоточиться субрегионе. Убедитесь, что стимуляция параметры были изменены, прежде чем перейти к следующему шагу. Возьмите одну картинку, чтобы увидеть, если мыть завершения (индивидуальных синапсов, должны быть четко точечные). Если нет, то увеличение расхода дополнительных 0.5mL/min, и ждать еще 2 минуты.

  8. После мытья завершения настройки экспозиции времени, сколько необходимо, чтобы продолжать получать хороший, четкий сигнал (обычно в пределах 50-100 мс. Выдержки раз должно быть сведено к минимуму из-за быстрого фотообесцвечивания FM). Затем установите timelapse предпочтения принять 38 изображений каждые 5 секунд. Проверьте перфузии сделать там достаточно HBS в течение еще 5 минут, и оставить перфузии течет. Начало timelapse начать destaining.

  9. После destain, изменение параметров стимуляции для доставки 1200 AP @ 10 Гц (обычно от 1200 до 2000 точек доступа используют для этого заключительного шага) на изображении 0. Выключите timelapse настройки и принять единый образ начать стимуляцию. Перфузии должны все еще быть течет Этот шаг поможет удалить все оставшиеся везикулярного FM краситель, с целью определения базовых / "общего разборных" флуоресценции. После стимул закончится, выключите стимуляции настройки, довести регион в фокусе. Закрыть перфузии и всасывания, А затем взять два последних изображения линии. Либо отдельные изображения или Z-стека изображений (с шагом 0,5 мкм) могут быть приняты. Z-стеки полезно в случае, произошел сдвиг в плоскости фокуса во время эксперимента.

  10. FM-эксперимент сделано. Если сразу делать больше экспериментов, объектива и камеры должны быть очищены от каждого испытания, но перфузии аппарат не должен быть очищен только после окончательного эксперимента. Промойте аппарат полностью с водой, затем этанолом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как 300 потенциалов действия (AP) является достаточным, чтобы вызвать по меньшей мере один раунд пузырьков переработки, загрузки стимулом 300 точек или более часто дают этикетку переработки пул везикул. Хотя более интенсивной загрузки стимулы, такие как 900 точек доступа, может позволить номинальный ряд дополнительных пузырьков, подлежащих маркировке, это также увеличивает количество времени красителя можете вставлять во внеклеточной оболочки, что ведет к повышению неспецифического окрашивания. Я обнаружил, мыть шаг к иметь решающее значение для обеспечения надлежащего destaining. Важно, чтобы заливать с расходом от 1 до 1,5 мл в минуту, как правило, 10 + 2 минут. Одно изображение может быть принято ~ 7 минут после мытья для мониторинга масштабов красителя удаления. При необходимости, скорость потока и или мыть время может быть немного увеличена. Для наших экспериментах было нежелательно для мытья приступить больше 10-12 минут, поскольку это увеличивает вероятность потери пузырьков маркировки через события спонтанного экзоцитоза, которые могут возникнуть даже тогда, когда клетка находится в покое. Для destaining шагом, от 900 до 1200 точек доступа вводили освободить всех меченых пузырьков. Кроме того, другой от 1200 до 2000 точек доступа были часто дается для получения базового значения "разборных флуоресценции", используется для нормализации destaining данных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics