Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

Biology

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Summary

Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff FM 4-64 markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release in Hippocampus-Neuronen Kulturen zu messen.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit FM-Farbstoff markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release zu überwachen. FM4-64 ist ein rot fluoreszierendes amphiphilen Styryl-Farbstoff, der in den Membranen von synaptischen Vesikeln bettet als Endozytose wird angeregt. Lipophile Wechselwirkungen verursachen den Farbstoff stark in der Fluoreszenz zu erhöhen, damit emittierende ein helles Signal, wenn mit Bläschen und eine Höchstdauer von einer, wenn in der extrazellulären Flüssigkeit verbunden. Nach einem Waschschritt wird zur Beseitigung von externen Farbstoff innerhalb der Plasmamembran, die restlichen FM in den Vesikeln konzentriert und ist dann ausgeschlossen, wenn Exozytose durch eine weitere Runde der elektrischen Stimulation induziert wird. Die Rate der Vesikel Release ist aus dem resultierenden Abnahme der Fluoreszenz gemessen. Da FM Farbstoff kann angewendet werden, externe und transient, es ist ein nützliches Werkzeug zur Bestimmung Preise der Exozytose in neuronalen Kulturen, vor allem beim Vergleich der Preise zwischen transfizierten Synapsen und benachbarten Kontrolle boutons.

Protocol

Cells: Ratte (oder Maus) primären hippokampalen neuronalen Kulturen (14-28 Tage in vitro).

Stimulation: Elektrotechnik, über zwei Platin-Elektroden geliefert; 70-90 mV

Mikroskopie: 60x Öl Objektiv auf eine invertierte CCD Fluoreszenzmikroskop.

Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA)

Siehe ergänzende Methoden für weitere Einzelheiten

  1. Warm HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS) auf Raumtemperatur. Fügen Sie die Glutamat-Rezeptor-Antagonisten APV (50 uM Endkonzentration) und CNQX (10 uM final). Jedes FM Experiment erfordert in der Regel 20-30 mL HBS. Für die Arbeit Konzentration von 10 uM FM 4-64 (Molecular Probes), verdünnte Stammlösung 1:1000 in HBS (mit Antagonisten hinzugefügt). Machen Sie 2 mL FM soln für jedes Experiment. Deckel-Lösung mit einer Folie gegen Licht zu verhindern.

  2. Montieren Sie die Deckgläschen mit den Neuronen auf die Elektrode Kammer. Überprüfen Sie, dass Medien in Kammer Ebene mit Oberseite der Kammer wird und vollständig deckt den Elektroden. Entfernen Sie überschüssige Lösung von der Unterseite des Deckglases. Öl in das Objektiv (bei Verwendung einer Öl-Objektiv).

  3. Richten Sie die Perfusionsapparatur. Zuerst mit ein paar mL des jeweiligen folgenden Spülen in der angegebenen Reihenfolge (let jeder Flow gründlich, bevor Sie die nächste): Wasser, Ethanol, Wasser, dann HBS. Als nächstes fügen Sie die HBS (außer ein paar mL von Hand in die künftigen Schritte hinzufügen) und schließen Sie die Perfusion. Richten Sie die Perfusion Steckdose und dem Sog an gegenüberliegenden Seiten an den Rändern des Deckglases. Es ist am besten, wenn die Perfusion Steckdose reicht bis in die Kammer, wo die Absaugung an der Spitze Rest sollte. Beim Hinzufügen von HBS (entweder durch Perfusion oder von Hand), öffnen Sie die Saug-und stellen Sie ihre Position so, dass es die Medien auf dem richtigen Niveau-nur komplett für den Elektroden führt.

  4. Achten Sie auf die Fläche auf dem Deckglas gewünschten Bild und versuchen, etwa bringen es im Mittelpunkt stehen. Optimale Bereiche enthalten viele Synapsen, sollte aber nicht so dicht sein, so dass die einzelnen Prozesse unterscheiden werden. Es sollte nicht zu gering Zellkörper, fremde Membranen (z. B. Gruppen von Astrozyten), oder andere unspezifische Materialien (z. B. Flusen). Die FM Farbstoff kann unspezifisch, um diese zu halten.

  5. Verwenden Sie die "WG"-Filter Würfel (die mit grünem Licht angeregt und sammelt rot-to-weit rot-Emissionen). Set SlideView "Capture-Einstellungen" auf 900 AP bei 10Hz liefern nach Einsetzen von Bild 0 (typischerweise 300 bis 900 APs sind für diesen Laden Stimulus). In dem Bild-Fenster wählen Sie die "fluo-vis-rot" Filter-Einstellungen und ändern Belichtungszeit auf 100 ms. Schalten Sie alle bereits vorhandenen Zeitraffer-Einstellungen. Nehmen Sie keine Bilder, bis Sie bereit Stimulation beginnen.

  6. Achten Sie darauf, die Absaugung auf / open. Schnelles Hinzufügen der FM-Lsg (2 mL), um die Kammer am anderen Ende der Saugleitung. Unmittelbar Ordnung Presse im Bildfenster, um ein Bild zu nehmen und beginnen Stimulation. Warten Sie 30-45 Sekunden nach der Stimulation und dann schnell auswaschen FM, indem ~ 2 ml HBS (Ich tue dies von Hand mit einer Pipette, aber dies kann auch durch Perfusion durchgeführt werden).

  7. Waschen Sie die FM mit HBS über Perfusion für ~ 10 Minuten. Die Durchflussrate sollte 1-1.5 ml / min sein. Während dieser Waschschritt, ändern Sie die Stimulation so einstellen, dass der Beginn der Stimulation beginnt @ Bild 10 (typischerweise 900 bis 1200 APs @ 10 Hz sind für diese Entfärbung Stimulus). Über 7 min in die Wäsche, überprüfen Sie die Einstellungen (Beginn des Stimulus auf Bild 10). Jetzt mit dem kleinen Fokus-Fenster wählen und sich einen Teilbereich. Sicherstellen, dass die Stimulation Einstellungen, bevor Sie fortfahren mit dem nächsten Schritt wurden geändert. Nehmen Sie ein einzelnes Bild zu sehen, ob die Wäsche vollständig ist (einzelne Synapsen sollten deutlich punktirt werden). Falls nicht, erhöhen die Fließgeschwindigkeit eine zusätzliche 0.5mL/min und warten weitere 2 Minuten.

  8. Einmal waschen abgeschlossen ist, stellen Sie die Belichtungszeit notwendig, noch erhalten ein gutes, klares Signal (in der Regel zwischen 50-100 ms. Belichtungszeiten sollten aufgrund der raschen Ausbleichen der FM minimiert werden). Dann stellen Sie den Zeitraffer Vorlieben zu treffen 38 Bilder alle 5 Sekunden. Überprüfen Sie die Durchblutung zu machen gibt es genug HBS für weitere 5 Minuten, und lassen Sie Perfusion fließt. Starten Zeitraffer zu beginnen Entfärbung.

  9. Nach Entfärben, ändern Stimulation Einstellungen auf 1200 AP @ 10Hz (in der Regel 1200 bis 2000 APs sind für diesen letzten Schritt verwendet) auf Bild 0 liefern. Schalten Sie den Zeitraffer-Einstellungen und nehmen Sie ein einzelnes Bild auf die Stimulation beginnen. Die Perfusion sollte noch fließenden Dieser Schritt wird dazu beitragen, entfernen Sie alle verbleibenden vesikulären FM Farbstoff, um Baseline / "total lösbare" Fluoreszenz zu bestimmen. Nach dem Reiz beendet ist, schalten Sie die Stimulation Einstellungen bringen die Region in den Fokus. Schließen Sie die Durchblutung und Saug-, Und dann zwei abschließenden Baseline Bilder. Entweder einzelne Bilder oder Z-Stapel-Bildern (0,5 mu m-Schritte) ergriffen werden können. Z-Stapel sind nützlich, wenn es eine Verschiebung in der Ebene der Fokus während des Experiments.

  10. Ihr FM Experiment durchgeführt wird. Wenn sofort mehr tun Experimente, sollte das Objektiv und Kammer zwischen jedem Versuch gereinigt werden, aber die Perfusionsapparatur muss nicht erst nach dem letzten Experiment gereinigt werden. Spülen Sie das Gerät vollständig mit Wasser, dann mit Ethanol.

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Discussion

AS 300 Aktionspotentiale (APs) ausreicht, um mindestens eine Runde von Vesikel-Recycling, ein Be-Stimulus von 300 APs oder mehr wird oft zur Kennzeichnung der Recycling-Pool von Vesikeln gegeben induzieren. Obwohl intensiver Belastung Reize, z. B. 900 APs, eine nominale Anzahl von zusätzlichen Vesikel gekennzeichnet werden können kann, erhöht dies auch die Zeit, die den Farbstoff in extrazelluläre Membranen eingebettet werden können, was zu mehr nicht-spezifische Färbung. Ich habe den Waschschritt, kritisch zu sein, um eine ordnungsgemäße Entfärben sicher gefunden. Es ist wichtig, mit Durchfluss von 1 bis 1,5 ml pro Minute, in der Regel für 10 + 2 Minuten perfuse. Ein einzelnes Bild kann ~ 7 Minuten in die Wäsche entnommen werden, um das Ausmaß der Farbstoff Entfernung zu überwachen. Falls erforderlich, kann die Strömungsgeschwindigkeit und oder Waschzeit leicht erhöht werden. Für unsere Experimente war es für nicht wünschenswert, die Wäsche zu gehen mehr als 10-12 Minuten, da dies erhöht die Wahrscheinlichkeit zu verlieren Vesikel-Kennzeichnung durch spontane Exozytose Ereignisse, die auch dann auftreten, wenn die Zelle in Ruhe kann. Für die Entfärbung Schritt wurden 900 bis 1200 APs verabreicht, um alle markierten Vesikel veröffentlichen. Zusätzlich anderen von 1200 bis 2000 APs wurden oft gegeben, einem Ausgangswert von "lösbaren Fluoreszenz", verwendet, um die Entfärbung Daten normalisieren zu erhalten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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