Mesure exocytose dans les neurones en utilisant un étiquetage FM

Biology

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Summary

La capacité de mesurer la cinétique de libération des vésicules peut aider à fournir un aperçu de certaines des bases de la neurotransmission. Ici nous avons utilisé l'imagerie en temps réel des vésicules étiquetés avec le rouge FM colorant fluorescent 4-64 pour mesurer le taux de libération des vésicules présynaptiques dans les cultures de neurones hippocampiques.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

La capacité de mesurer la cinétique de libération des vésicules peut aider à fournir un aperçu de certaines des bases de la neurotransmission. Ici nous avons utilisé l'imagerie en temps réel des vésicules étiquetés avec FM colorant pour surveiller le taux de libération des vésicules présynaptiques. FM4-64 est un colorant fluorescent rouge amphiphiles styryle qui embarque dans les membranes des vésicules synaptiques que l'endocytose est stimulée. Interactions lipophiles provoquer la teinture d'augmenter fortement la fluorescence, émettant ainsi un signal lumineux lorsqu'ils sont associés à des vésicules et un nominal quand dans le liquide extracellulaire. Après une étape de lavage est utilisée pour aider à enlever le colorant externes au sein de la membrane plasmique, le reste FM est concentrée dans les vésicules et est ensuite expulsé lors exocytose induite par un autre tour de la stimulation électrique. Le taux de libération de vésicules est mesurée par la diminution résultant de la fluorescence. Depuis FM colorant peut être appliqué externe et transitoire, il est un outil utile pour déterminer les taux de l'exocytose dans les cultures de neurones, surtout quand on compare les taux entre les synapses et les boutons de contrôle transfectées voisins.

Protocol

Cellules: Rat (ou la souris) primaire cultures de neurones hippocampiques (14-28 jours in vitro).

Stimulation: électrique, livré par deux électrodes de platine; 70-90 mV

Microscopie: lentille d'huile 60x sur un microscope inversé CCD fluorescentes.

Logiciel: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, Californie)

Voir la page supplémentaire méthodes pour plus de détails

  1. Chaud une solution saline tamponnée HEPES (HBS) à température ambiante. Ajouter les antagonistes des récepteurs de glutamate APV (50 uM de concentration finale) et CNQX (10 pM final). Chaque expérience FM nécessite généralement 20-30 ml de HBS. Pour travailler la concentration de 10 uM FM 4-64 (Molecular Probes), diluer 1:1000 solution stock dans HBS (avec des antagonistes ajoutée). Faire 2 ml FM soln pour chaque expérience. Couvrir avec une feuille solution pour éviter l'exposition lumineuse.

  2. Montez la lamelle contenant les neurones sur la chambre de l'électrode. Vérifiez que les médias dans la chambre est au niveau haut de la chambre et le couvre complètement les électrodes. Retirez tout excès de solution de fond de la lamelle. Ajouter l'huile de la lentille (si vous utilisez une lentille de pétrole).

  3. Mettre en place l'appareil de perfusion. Rincer d'abord quelques mL de chaque année suivant l'ordre donné dans le (laissez chaque flux une profondeur avant d'ajouter le suivant): l'eau, l'éthanol, l'eau, puis HBS. Ensuite, ajoutez l'EBM (sauf quelques mL d'ajouter à la main dans les étapes futures) et proche de la perfusion. Mettre en place la prise de perfusion et de l'aspiration sur les côtés opposés sur les bords de la lamelle. Il est préférable que la prise de perfusion atteint dans la chambre, où, comme l'aspiration doit reposer tout en haut. Tout en ajoutant HBS (soit par perfusion ou à la main), ouvrez l'aspiration et d'ajuster sa position afin qu'il conserve les médias au niveau de la droite, juste recouvrant entièrement les électrodes.

  4. Cherchez la zone sur la lamelle à l'image que vous souhaitez et d'essayer de le mettre à peu près au point. Zones optimales contiennent nombreuses synapses, mais ne devrait pas être si denses telles que les processus individuels deviennent indiscernables. Il ne devrait pas être à un minimum les corps cellulaires, les membranes extérieures (telles que des touffes d'astrocytes), ou d'autres matériaux non spécifiques (tels que les peluches). Le colorant non spécifique FM peuvent adhérer à ces derniers.

  5. Utilisez le "GT" cube filtre (qui excite avec la lumière verte et recueille rouge-à-jour des émissions en rouge). Réglez "préférences de capture" SlideView pour livrer 900 AP à 10Hz sur l'apparition de l'image de 0 (généralement de 300 à 900 points d'accès sont utilisés pour cette relance de chargement). Dans la fenêtre d'image, sélectionnez l'option "fluo-vis-rouge" des paramètres de filtre et changer le temps d'exposition à 100 ms. Éteignez tous les paramètres timelapse pré-existante. Ne prenez pas toutes les images jusqu'à ce que vous êtes prêt à commencer la stimulation.

  6. Assurez-vous que l'aspiration est sur / ouvert. Ajouter rapidement le soln FM (2 ml) à la chambre à l'extrémité opposée de l'aspiration. Appuyez immédiatement sur OK dans la fenêtre d'image pour prendre une image et de commencer la stimulation. Attendre 30 à 45 secondes après la stimulation, puis rapidement laver FM en ajoutant ~ 2 ml de HBS (je le fais à la main avec une pipette, mais cela peut aussi être fait par perfusion).

  7. Laver la FM avec HBS par perfusion pour ~ 10 minutes. Le débit devrait être de 1 à 1,5 ml / min. Durant cette étape de lavage, changer les préférences de stimulation de sorte que le début de la stimulation commence @ 10 images (généralement de 900 à 1200 points d'accès @ 10 Hz sont utilisées pour ce stimulus décoloration). Environ 7 min dans le lavage, vérifier les préférences (apparition de stimulus à l'image 10). Maintenant, en utilisant la fenêtre de petit foyer choisir et de se concentrer une sous-région. Assurez-vous que les paramètres de stimulation ont été changés avant de procéder à l'étape suivante. Prenez une seule image pour voir si le lavage est terminé (synapses individuelles doivent être clairement pointillée). Si non, augmenter le débit une 0.5mL/min supplémentaires, et d'attendre encore 2 minutes.

  8. Une fois de lavage est terminé, régler le temps d'exposition nécessaires pour continuer de recevoir un bon signal clair (généralement entre 50-100 ms. Temps d'exposition doit être minimisée en raison de photoblanchiment rapide de la FM). Ensuite définir les préférences timelapse de prendre 38 images toutes les 5 secondes. Vérifiez la perfusion de faire il ya assez de HBS pendant 5 minutes, et de laisser couler la perfusion. Démarrer timelapse pour commencer décoloration.

  9. Après Décolorer, modifier les paramètres de stimulation pour livrer 1200 @ 10Hz AP (généralement de 1200 à 2000 points d'accès sont utilisés pour cette étape finale) sur l'image 0. Désactivez les paramètres timelapse et de prendre une seule image pour commencer la stimulation. La perfusion doit être encore couler Cette étape permettra d'éliminer toute vésiculaires reste de teinture FM, afin de déterminer de base / «total libérable" par fluorescence. Après la relance est terminée, éteignez les paramètres de stimulation, mettre la région dans le foyer. Fermer la perfusion et aspiration, Puis prendre deux images de référence finale. Soit des images simples ou des images Z-stack (0,5 um étapes) peuvent être prises. Z-piles sont utiles dans le cas où il a été un changement dans le plan de mise au point pendant l'expérience.

  10. Votre expérience FM est fait. Si immédiatement faire plus d'expériences, la lentille et la chambre doit être nettoyée entre chaque essai, mais l'appareil de perfusion ne doit pas être nettoyée qu'après l'expérience finale. Rincer l'appareil entièrement avec de l'eau, puis de l'éthanol.

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Discussion

Comme 300 des potentiels d'action (AP) est suffisante pour induire au moins un tour de recyclage des vésicules, une relance de chargement de 300 points d'accès ou plus est souvent donnée à l'étiquette de la piscine de recyclage des vésicules. Bien que les stimuli de chargement plus intenses, tels que 900 points d'accès, peut permettre à un nombre nominal de vésicules supplémentaire à être étiquetés, ce qui augmente également la quantité de temps, le colorant peut intégrer dans les membranes extracellulaires, conduisant à une plus grande coloration non spécifique. J'ai trouvé l'étape de lavage d'être critique pour assurer décoloration appropriée. Il est important pour perfuser avec un débit de 1 à 1,5 ml par minute, généralement pour 10 + 2 minutes. Une seule image peut être pris environ 7 minutes dans le lavage de surveiller l'ampleur de l'enlèvement de teinture. Si nécessaire, le débit et ou le temps de lavage peut être légèrement augmenté. Pour nos expériences, il n'était pas souhaitable pour le lavage de procéder supérieure à 10-12 minutes car cela augmente la probabilité de perdre des vésicules-étiquetage à travers des événements d'exocytose spontanée qui peut se produire même lorsque la cellule est au repos. Pour l'étape de décoloration, de 900 à 1200 points d'accès ont été administrés à libérer tous les vésicules étiquetés. De plus une autre de 1200 à 2000 points d'accès ont souvent été donnés pour obtenir une valeur de référence de «fluorescence libérable", utilisée pour normaliser les données de décoloration.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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