Misurare esocitosi nei neuroni Utilizzando Etichettatura FM

Biology

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Summary

La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole etichettati con il colorante rosso fluorescente FM 4-64 per misurare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche in culture neuronali dell'ippocampo.

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Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

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Abstract

La capacità di misurare la cinetica di rilascio delle vescicole può contribuire a fornire indicazioni in alcuni dei principi fondamentali della neurotrasmissione. Qui abbiamo usato imaging in tempo reale delle vescicole marcato con FM colorante per monitorare la velocità di rilascio delle vescicole presinaptiche. FM4-64 è un colorante rosso fluorescente anfifilici styryl che incorpora nelle membrane delle vescicole sinaptiche come endocitosi è stimolata. Interazioni lipofile causa del colorante per aumentare notevolmente in fluorescenza, così che emette un segnale luminoso quando associata a vescicole e una nominale quando nel liquido extracellulare. Dopo una fase di lavaggio viene usato per aiutare a rimuovere colorante esterno all'interno della membrana plasmatica, il restante FM è concentrata all'interno del vescicole e poi viene espulso quando esocitosi è indotta da un altro ciclo di stimolazione elettrica. Il tasso di rilascio delle vescicole è misurata dalla conseguente diminuzione della fluorescenza. Dal FM tintura può essere applicata esterni e transitoriamente, è uno strumento utile per determinare i tassi di esocitosi nelle culture neuronali, specialmente quando si confrontano i tassi tra le sinapsi transfettate e boutons controllo limitrofe.

Protocol

Celle: Rat (o il mouse) colture primarie di neuroni dell'ippocampo (14-28 giorni in vitro).

Stimolazione: elettrica, consegnato tramite due elettrodi di platino; 70-90 mV

Microscopia: lente olio 60x su un microscopio invertito a fluorescenza CCD.

Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA)

Vedi supplementare pagina metodi per ulteriori dettagli

  1. Caldo HEPES soluzione salina tamponata (SPA) a temperatura ambiente. Aggiungere il glutammato antagonisti dei recettori APV (50 microM concentrazione finale) e CNQX (10 mM finale). Ogni esperimento FM di solito richiede 20-30 ml HBS. Per lavorare concentrazione di 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes), soluzione madre diluita 1:1000 in HBS (con gli antagonisti aggiunto). Fai 2 ml FM soln per ciascun esperimento. Coprire con un foglio di soluzione per evitare l'esposizione alla luce.

  2. Montate il coprioggetti contenente i neuroni sulla camera di elettrodi. Controllare che i media in camera è di livello con la parte superiore della camera e copre completamente gli elettrodi. Rimuovere qualsiasi soluzione in eccesso dalla parte inferiore del coprioggetto. Aggiungere l'olio alla lente (se si utilizza una lente d'olio).

  3. Sistemare il dispositivo di perfusione. Prima sciacquare con pochi ml di ognuno di noi seguiva la nell'ordine dato (lasciamo che ognuno di flusso a fondo prima di aggiungere il successivo): acqua, etanolo, acqua, poi HBS. Ora aggiungete il HBS (salvo pochi millilitri di aggiungere a mano nelle fasi successive) e chiudere la perfusione. Impostare la presa di perfusione e l'aspirazione sui lati opposti ai bordi del coprioggetto. E 'meglio se la presa di perfusione raggiunge nella camera, dove, come l'aspirazione deve rimanere in cima. Mentre l'aggiunta di HBS (sia per perfusione oa mano), aprire l'aspirazione e regolarne la posizione in modo che mantenga la media a destra livello appena a coprire interamente gli elettrodi.

  4. Cercare l'area sul vetrino che si desidera immagine e cercare di portare o meno a fuoco. Aree ottimali contengono molte sinapsi, ma non dovrebbe essere così densa in modo tale che i singoli processi diventano indistinguibili. Non ci dovrebbero essere-per-minimal corpi cellulari, membrane estranei (come ad esempio macchie di astrociti), o altri materiali non specifici (come ad esempio lint). Il colorante non specifico FM può aderire a questi.

  5. Utilizzare il cubo filtro "WG" (che eccita con la luce verde e raccoglie le emissioni rosso rosso-to-lontano). Impostare SlideView "preferenze di cattura" per fornire 900 AP a 10Hz su insorgenza di immagine 0 (di solito 300-900 AP sono utilizzati per questo stimolo carico). Nella finestra immagine, selezionare l'opzione "fluo-vis-rosso" impostazioni del filtro e cambiare il tempo di esposizione di 100 ms. Disattivare qualsiasi pre-esistente impostazioni timelapse. Non prendere le immagini fino a quando si è pronti per iniziare la stimolazione.

  6. Assicurarsi che l'aspirazione è su / aperto. Aggiungere rapidamente le soln FM (2 ml) alla camera dalla parte opposta della aspirazione. Premere immediatamente ok nella finestra dell'immagine per scattare una foto e iniziare la stimolazione. Attendere 30-45 secondi dopo la stimolazione e poi rapidamente lavare FM con l'aggiunta di ~ 2 ml di HBS (lo faccio a mano con una pipetta, ma questo può essere fatto anche da perfusione).

  7. Lavare la FM con HBS tramite perfusione per ~ 10 minuti. La portata dovrebbe essere 1-1,5 ml / min. Durante questa fase di lavaggio, cambiare le preferenze di stimolazione in modo che l'inizio della stimolazione inizia immagine @ 10 (di solito 900-1200 AP @ 10 Hz sono usati per questo stimolo decolorazione). Circa 7 min nel lavare, controllare le preferenze (insorgenza di stimolo a immagine 10). Ora, utilizzando la finestra piccola attenzione scegliere e mettere a fuoco una sottoarea. Assicurarsi che le impostazioni di stimolazione sono stati cambiati prima di procedere alla fase successiva. Prendete una singola immagine per vedere se il lavaggio è completo (singole sinapsi devono essere chiaramente punctated). In caso contrario, aumentare la portata 0.5mL/min uno aggiuntivo, e attendere altri 2 minuti.

  8. Una volta lavaggio è completo, regolare il tempo di esposizione necessario per ricevere ancora una buona, chiaro segnale (di solito tra 50-100 ms. Tempi di esposizione dovrebbe essere ridotto al minimo a causa di photobleaching rapido della FM). Quindi impostare le preferenze Timelapse prendere 38 immagini ogni 5 secondi. Controllare la perfusione di fare c'è abbastanza HBS per altri 5 minuti, e lasciare scorrere la perfusione. Inizio timelapse per iniziare decolorazione.

  9. Dopo Decolorare, modificare le impostazioni stimolo per fornire 1200 AP @ 10Hz (solitamente 1200-2000 AP è utilizzata in questa fase finale) su immagine 0. Disattivare le impostazioni timelapse e prendere una singola immagine per iniziare la stimolazione. La perfusione deve essere ancora scorre Questo passo consentirà di eliminare eventuali rimanenti colorante vescicolare FM, per determinare baseline / "totale rilasciabili" fluorescenza. Dopo lo stimolo è terminato, disattivare le impostazioni stimolazione, portare la regione a fuoco. Chiudere la perfusione e di aspirazione, E poi prendere due immagini di riferimento finale. Sia immagini singole o Z-stack immagini (0,5 punti micron) possono essere prese. Z-stack sono utili nel caso ci fosse un cambiamento nel piano di messa a fuoco durante l'esperimento.

  10. L'esperimento FM è fatto. Se immediatamente fare di più esperimenti, l'obiettivo e la camera dovrebbe essere puliti ogni prova, ma l'apparato perfusione non devono essere puliti fino a dopo l'esperimento finale. Sciacquare l'apparato completamente con acqua, poi l'etanolo.

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Discussion

Di 300 potenziali d'azione (AP) è sufficiente per indurre almeno un giro di riciclaggio delle vescicole, uno stimolo di carico di 300 o più punti di accesso è spesso dato per etichettare il riciclo del pool di vescicole. Anche se gli stimoli di carico più intenso, come 900 punti di accesso, può consentire a un numero nominale di vescicole aggiuntivi da etichettare, questo aumenta anche la quantità di tempo che il colorante possibile incorporare nelle membrane extracellulare, portando ad una maggiore colorazione aspecifica. Ho trovato la fase di lavaggio ad essere critici per garantire la corretta decolorazione. E 'importante perfusione con portata 1 a 1,5 ml per minuto, di solito per 10 + 2 minuti. Una singola immagine può essere preso ~ 7 minuti dopo il lavaggio di monitorare il grado di rimozione colorante. Se necessario, la portata e o tempo di lavaggio può essere leggermente aumentata. Per i nostri esperimenti è stata indesiderabile per il lavaggio di procedere superiore a 10-12 minuti in quanto ciò aumenta la probabilità di perdere la vescicola di etichettatura attraverso gli eventi esocitosi spontanea che può verificarsi anche quando la cellula è a riposo. Per la fase di decolorazione, 900-1200 AP sono stati somministrati a rilasciare tutte le vescicole etichettati. Inoltre un altro 1200-2000 AP sono stati spesso dato per ottenere un valore di base di "fluorescenza rilasciabili", utilizzato per normalizzare i dati decolorazione.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

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References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

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