Mätning exocytos i de nervceller Använda FM-märkning

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Förmågan att mäta kinetiken av vesikler utgåva kan bidra till att ge inblick i några av grunderna i neurotransmission. Här har vi använt i realtid avbildning av blåsor märkt med röd fluorescerande färg FM 4-64 för att mäta graden av presynaptiska vesikler release i hippocampus neuronala kulturer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Förmågan att mäta kinetiken av vesikler utgåva kan bidra till att ge inblick i några av grunderna i neurotransmission. Här har vi använt i realtid avbildning av blåsor märkta med FM-färg för att kontrollera graden av presynaptiska vesikler release. FM4-64 är en röd fluorescerande amfifila styryl färg som bäddar in i membranen av synaptiska vesikler som endocytos stimuleras. Lipofila växelverkan orsakar färgen att kraftigt öka i fluorescens och därmed avger en ljus signal när förknippas med blåsor och en nominell en när i den extracellulära vätskan. Efter en tvätt steg används för att ta bort externa färgämnet i plasmamembranet, är den återstående FM koncentrerade inom blåsor och sedan utvisas när exocytos framkallas av en annan runda av elektrisk stimulering. Graden av blåsor släppa mäts från den resulterande minskningen i fluorescens. Eftersom FM färgen kan appliceras yttre och övergående, det är ett användbart verktyg för att bestämma andelen exocytos i neuronala kulturer, särskilt när man jämför priser mellan transfekterade synapser och angränsande boutons kontroll.

Protocol

Celler: Rat (eller mus) primära hippocampus neuronala kulturer (14-28 dagar in vitro).

Stimulering: Elektrisk, levereras via två platina elektroder, 70-90 mV

Mikroskopi: 60x olja linsen på ett inverterat CCD fluorescerande mikroskop.

Programvara: Slidebook (Intelligent Imaging Innovationer, Santa Monica, Kalifornien)

Se kompletterande metoder sida för mer information

  1. Varm HEPES-saltlösning (HUT) till rumstemperatur. Lägg till glutamat-antagonister APV (50 mikroM slutlig koncentration) och CNQX (10 mikroM slutlig). Varje FM experiment kräver oftast 20-30 ml HBS. För arbete koncentration på 10 mikroM FM 4-64 (molekylära sonder), späd stamlösning 1:1000 i HBS (med antagonister läggs till). Gör 2 mL FM flytande lösningsmedel för varje experiment. Täck lösning med folie för att förhindra ljus.

  2. Montera täckglas som innehåller nervceller på elektroden kammaren. Kontrollera att media i kammaren är i nivå med toppen av kammaren och helt täcker elektroderna. Ta bort överflödig lösning från botten av täckglas. Tillsätt olja till linsen (om du använder en olja objektiv).

  3. Sätt upp perfusion apparaten. Först skölj med några ml av varje följande i angiven ordning (låt var och en flöda ordentligt innan du lägger på nästa): vatten, etanol, vatten och sedan HBS. Tillsätt därefter den harmoniserade balansräkningen (spara några ml för att lägga till för hand i framtiden steg) och stäng perfusion. Ställ upp perfusionen utlopp och sug på motsatta sidor i kanterna av täckglas. Det är bäst om perfusionen utlopp når in i kammaren, där som sug ska vila på den absoluta toppen. Men tillägger samtidigt HBS (antingen genom perfusion eller för hand), öppna sug och justera dess position så att den håller media på rätt nivå, precis täcker den elektroderna.

  4. Titta efter det område på täckglas du vill bilden och försöka ungefär ta med den i fokus. Optimal områden innehåller många synapser, men bör inte vara så tät så att enskilda processer blir omöjliga att särskilja. Det bör inte vara till minimal cell organ, yttre membran (som klumpar av astrocyter) eller andra icke-specifik material (exempelvis ludd). FM-färgämnet kan ospecifikt följer dessa.

  5. Använd "WG" filter kub (som hetsar med grönt ljus och samlar rött till långt rött utsläpp). Ställ SlideView "fånga preferenser" för att leverera 900 AP vid 10Hz vid insättande bild 0 (vanligtvis 300 till 900 accesspunkter används för lastning stimulans). I bildfönstret, välj "lys-vis-röda" filterinställningar och ändra exponeringstiden till 100 ms. Stäng av alla redan existerande Timelapse inställningar. Ta inga bilder förrän du är redo att börja stimulering.

  6. Se till att sug är på / öppen. Snabbt lägga FM flytande lösningsmedel (2 ml) till kammaren i den motsatta änden av sug. Omedelbart tryck okej i bildfönstret för att ta en bild och börja stimulans. Vänta 30-45 sekunder efter stimulering och sedan snabbt tvätta ur FM genom att lägga ~ 2 mL HBS (Jag gör detta för hand med en pipett, men detta kan också ske genom perfusion).

  7. Tvätta FM med HBS via perfusion för ~ 10 minuter. Flödet bör vara 1-1,5 ml / min. Under tvättningen, ändra stimulans inställningarna så att uppkomsten av stimuleringen börjar @ bild 10 (vanligen 900 till 1200 AP @ 10 Hz används för avfärgning stimulus). Omkring 7 min in i tvätta, dubbelkolla preferenser (uppkomsten av stimulans i bild 10). Nu med det lilla fokus fönstret välja och fokusera en delregion. Se till att stimulering inställningarna har ändrats innan du fortsätter till nästa steg. Ta en enda bild för att se om tvätten är klar (enskilda synapser bör tydligt punctated). Om inte, öka flödet ytterligare 0.5mL/min och vänta ytterligare 2 minuter.

  8. När tvätt är klar justerar exponeringstid som behövs för att fortfarande få en bra, tydlig signal (vanligtvis mellan 50-100 ms. Exponeringstider bör minimeras på grund av snabb fotoblekning av FM). Ställ sedan in timelapse förmånsbehandling för att ta 38 bilder varje 5 sekunder. Kontrollera perfusionen att det finns tillräckligt med HBS i ytterligare 5 minuter och lämna perfusion flödar. Starta Timelapse att börja avfärgning.

  9. Efter Avfärga, ändra stimulering inställningar för att leverera 1200 AP @ 10Hz (typiskt 1200 till 2000 accesspunkter används för detta sista steg) på bild 0. Stäng av timelapse inställningar och ta en enda bild för att börja stimulering. Perfusionen bör ändå flödar Detta steg kommer att ta bort alla återstående SVD FM färg, för att avgöra baseline / "totala öppningsbara" fluorescens. Efter att stimulans är klar, stäng av stimuleringen inställningar, sätta regionen i fokus. Stäng perfusion och sugOch sedan ta två sista baslinjen bilder. Antingen enstaka bilder eller Z-stack bilder (0,5 ìm steg) kan vidtas. Z-staplar är användbara i de fall det fanns en förskjutning i planet i fokus under experimentet.

  10. FM experiment görs. Om omedelbart göra fler experiment bör linsen och kammarmusiker rengöras mellan varje försök, men perfusionen apparaten behöver inte rengöras förrän efter det sista experimentet. Skölj apparaten helt med vatten och sedan etanol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som 300 aktionspotentialer (APS) är tillräcklig för att framkalla åtminstone en runda av vesikler återvinning, en lastning stimulans på 300 accesspunkter eller mer ges ofta för att märka återvinning pool av blåsor. Även om mer intensiv lastning stimuli, såsom 900 accesspunkter, kan möjliggöra en nominell antal ytterligare blåsor som ska märkas, ökar detta också den tid färgen kan bädda in i extracellulärt membran, vilket leder till större icke-specifik färgning. Jag har hittat tvättningen att vara kritisk för att säkerställa korrekt avfärgning. Det är viktigt att BEGJUTA med flöde på 1 till 1,5 ml per minut, oftast för 10 + 2 minuter. En enda bild kan tas ~ 7 minuter in i tvätta för att övervaka omfattningen av färgämne bort. Vid behov kan flödet och eller tvätta tiden ökat något. För våra experiment var det önskvärt att tvätta att gå mer än 10-12 minuter eftersom detta ökar sannolikheten för att förlora vesikler-märkning genom spontan exocytos händelser som kan inträffa även när cellen är i vila. För avfärgning steget var 900 till 1200 AP ges till frige alla märkta blåsor. Dessutom har en 1200 till 2000 accesspunkter ofta ges för att få ett utgångsvärde på "frisläppas fluorescens", används för att normalisera avfärgning data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics