Nöronlar FM Etiketleme kullanarak ölçüm ekzositoz

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada kırmızı floresan boya FM 4-64 etiketli veziküller presinaptik hipokampal nöron kültürlerinde vezikül serbest hızını ölçmek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vezikül serbest kinetiği ölçmek için yeteneği nörotransmisyon bazı temel içgörü sağlamak yardımcı olabilir. Burada FM boya ile etiketlenmiş veziküller presinaptik vezikül bırakma oranı izlemek için gerçek zamanlı görüntüleme kullanılır. FM4-64 endositoz uyarılmış olarak sinaptik veziküllerin membranlar içine gömer kırmızı floresan amfifilik styryl boya. Lipofilik etkileşimleri boya büyük veziküller ve nominal bir ekstrasellüler sıvı ile ilişkili böylece parlak bir sinyal yayan floresan artışa neden olur. Yıkama adım, plazma zarı içinde dış boya kaldırmanıza yardımcı kullanıldıktan sonra, kalan FM veziküller içinde yoğunlaşmıştır ve ekzositoz, elektrik stimülasyonu başka bir yuvarlak ile indüklenen zaman sonra atılır. Floresans ortaya çıkan düşüşten vezikül serbest oranı ölçülür. FM boya geçici dış uygulanır ve olabilir bu yana, özellikle transfekte sinaps ve komşu kontrolü BOUTONS arasında oranlarını karşılaştırarak, nöronal kültürlerin ekzositoz oranlarının belirlenmesi için yararlı bir araçtır.

Protocol

Hücreler: Rat (veya fare) primer hipokampal nöron kültürleri (in vitro 14-28 gün).

Uyarım: Elektrik, iki platin elektrot ile teslim; 70-90 mV

Mikroskopi: ters bir CCD floresan mikroskop 60x petrol objektif.

Yazılım: Slidebook (Akıllı Görüntüleme Yenilikler, Santa Monica, CA)

Daha fazla ayrıntı için tamamlayıcı yöntemler sayfasına bakınız

  1. Warm Hepes-tamponlu salin (HBS) oda sıcaklığında. Glutamat reseptör antagonistleri APV (50 mcM son konsantrasyon) ve CNQX (10 mcM son) ekleyin. Her FM deney genellikle 20-30 ml HBS gerektirir. 10 mcM FM 4-64 (Molecular Probes) konsantrasyonu çalışmalar için, (antagonistleri eklenmiş) HBS stok solüsyonu 1:1000 sulandırmak. Her bir deney için 2 mL FM soln olun. Çözüm ışık maruz kalmayı önlemek için folyo ile örtün.

  2. Nöron içeren elektrot odasının üzerine lamel monte edin. Medya odasında odasının üst düzeyi olup olmadığını kontrol edin ve tamamen elektrotlar kapsar. Lamel altındaki herhangi bir aşırı çözüm çıkarın. Lens (bir petrol lens kullanıyorsanız) yağı ekleyin.

  3. Perfüzyon aparat ayarlayın. Su, etil alkol, su, daha sonra HBS: İlk verilen sipariş (sonraki eklemeden önce iyice her biri akışını sağlar) her biri aşağıdaki birkaç mL ile durulayın. Sonraki HBS (gelecekteki adımları elle eklemek için birkaç ml kaydedin) ve perfüzyon yakın. Lamel kenarlarında ters taraftan perfüzyon çıkışı ve emme ayarlayın. Emme en üst kısmında geri kalanı nerede olarak perfüzyon çıkışı odasına ulaşırsa en iyisidir. HBS (ya perfüzyon veya elle) eklerken sağ taraftaki medya seviyesi sadece elektrotları tam kapsayan korur, böylece emiş açmak ve kendi konumunu ayarlamak.

  4. Görüntü isteyen ve kabaca odak getirmeyi deneyin lamel alanı için bak. Optimal alanlarda çok sayıda sinaps içerir, ancak bireysel süreçleri ayırt edilemez hale gelir böyle çok yoğun olmamalıdır. Olmamalıdır hiç-minimal hücre gövdeleri, gereksiz membranlar (astrosit kümeleri gibi), ya da diğer nonspesifik malzemeleri (örneğin, tüy bırakmayan gibi). FM boya nonspecifically bu uygun olabilir.

  5. (Yeşil ışık heyecanlandıran ve kırmızı-uzak kırmızı emisyon toplar) "WG" filtre küp kullanın. 0 (genellikle 300 900 AP'ler Bu yükleme uyaran için kullanılır) görüntü başlaması üzerine 10Hz az 900 AP sunmak için SlideView "yakalama tercihleri" ayarlayın. Görüntü penceresinde, "fluo-vis-kırmızı" filtre ayarları seçin ve maruz kalma süresi 100 ms değiştirin. Önceden varolan timelapse ayarları kapatın. Stimülasyon başlatmak için hazır olana kadar herhangi bir görüntü almayın.

  6. Emme açık açık / kapalı olduğundan emin olun. Hızla emme ters sonunda odasına FM soln (2 ml) ekleyin. Hemen bir görüntü çekmek ve stimülasyon başlamak için görüntü penceresinde tamam tuşuna basın. Stimülasyon sonra 30-45 saniye bekleyin ve sonra hızlı bir şekilde yaklaşık 2 mL HBS (bir pipet yardımıyla elle Bunu yapmak için, ama bu da perfüzyon tarafından yapılabilir) ekleyerek FM yıkayın.

  7. ~ 10 dakika perfüzyon yoluyla FM HBS ile yıkayın. Akış hızı 1-1.5 ml / dak olmalıdır. Bu yıkama adım sırasında, stimülasyon başlangıcında başlar, böylece uyarılması tercihlerini değiştirmek @ görüntü 10 (genellikle 900 ila 1200 AP'ler @ 10 Hz bu destaining uyaran için kullanılır). Yıkama içine 7 dk Hakkında tercihleri ​​(görüntü uyaranın başlangıcından 10), çift kontrol edin. Şimdi küçük bir odak pencereyi seçin ve subregion odağı. Stimülasyon ayarları bir sonraki adıma geçmeden önce değiştirilmiş olduğundan emin olun. Yıkama tam olup olmadığını görmek için tek bir görüntü (bireysel sinaps açıkça noktalı olmalıdır) atın. Aksi takdirde, akış oranı ek bir 0.5mL/min artış ve başka bir 2 dakika bekleyin.

  8. Bir kez yıkamak tam, (genellikle 50-100 ms Pozlama süreleri arasında FM hızlı photobleaching nedeniyle minimize edilmelidir) yine de iyi ve net bir sinyal almak için gerektiği gibi pozlama süresi ayarlayabilirsiniz. Daha sonra her 5 saniyede 38 görüntü almak için timelapse tercihlerinizi ayarlayabilirsiniz. HBS başka bir 5 dakika yeterli perfüzyon kontrol edin ve perfüzyon akan bırakın. Destaining başlamak için timelapse başlayın.

  9. Destain sonra, resmin 0 üzerine 1200 AP @ 10Hz (genellikle 1200 - 2000 AP'ler bu son adım için kullanılır) sunmak için stimülasyon ayarlarını değiştirmek. Timelapse ayarları kapatın ve stimülasyon başlamak için tek bir görüntü alabilir. Perfüzyon Bu adım, başlangıçtaki / "toplam açıklanmaması" floresan belirlemek için, kalan veziküler FM boya giderilmesine yardımcı olur, akıcı olmalıdır. Uyaran tamamlandıktan sonra, uyarılması ayarlarını kapatmak bölgenin odak noktası haline getirmek. Perfüzyon ve emme kapatınVe ardından son iki temel görüntüleri çekmek. Tek görüntü veya Z-yığın görüntüleri (0.5 mikron adımları) Ya alınabilir. Z-yığınlar, deney sırasında odak düzlemi bir kayma vardı durumunda yararlıdır.

  10. FM deney yapılır. Hemen daha fazla deney yapıyorsanız, her deneme arasında objektif ve oda temizlenir, ancak perfüzyon cihaz son deney sonrasına kadar temizlenmesi gerekmez olmalıdır. Cihazın, daha sonra su, etanol ile tamamen durulayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

300 aksiyon potansiyelleri (AP), vezikül geri dönüşüm en azından bir tur, 300 AP'ler veya daha sık veziküllerin geri dönüşüm havuzu etiket verilir yükleme uyaran ikna etmek için yeterli. 900 AP'ler gibi daha yoğun yükleme uyaranlara, etiketli ek veziküllerin nominal izin verebilir rağmen, bu da daha fazla non-spesifik boyanması için boya ekstrasellüler membranlar gömebilirsiniz süreyi artırır. Ben, doğru destaining sağlamak için kritik bir yıkama adım bulduk. Genellikle 10 için akış hızı dakikada 1 - 1,5 ml + 2 dakika serpmek için önemlidir. ~ 7 dakika yıkama boya kaldırma ölçüde izlemek için tek bir görüntü alınabilir. Gerekirse, akış hızı ve yıkama süresi biraz daha artmış olabilir. Deneyler için bu hücre istirahat halindeyken bile meydana gelebilir spontan ekzositoz olayları aracılığıyla vezikül-etiketleme kaybetme olasılığını artırır olarak 10-12 dakika daha fazla devam etmek için yıkama için istenmeyen oldu. Destaining adım için, 900 ila 1200 AP'ler etiketli tüm veziküller serbest uygulandı. Ayrıca başka bir 1200 ile 2000 AP'ler genellikle destaining verileri normalleştirmek için kullanılan "açıklanmaması floresan" temel değeri elde etmek için verildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics