Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Newton, J., Murthy, V. Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling. J. Vis. Exp. (1), e117, doi:10.3791/117 (2006).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczony FM barwnika do monitorowania tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych. FM4-64 jest czerwony barwnik fluorescencyjny amfifilowych styrylowe, który osadza się w błony pęcherzyków synaptycznych jak endocytozy jest stymulowany. Lipofilowych interakcje powodują barwnika do znacznego zwiększenia fluorescencji, a tym samym emituje jasny sygnał, kiedy wiąże się z pęcherzami i nominalnej jeden, gdy w płynie pozakomórkowym. Po etapie mycia służy do usuwania zewnętrznych barwnik w błonie komórkowej, pozostałe FM jest skoncentrowana w pęcherzyki, a następnie wydalony przy egzocytozy jest wywołane kolejną rundę stymulację elektryczną. Szybkość uwalniania pęcherzyków jest mierzona od spadku w wyniku fluorescencji. Od FM barwnika może być stosowany przejściowo i zewnętrznych, jest to użyteczne narzędzie do ustalania stawek egzocytozy w neuronalnych kultur, zwłaszcza przy porównywaniu kursów pomiędzy transfekowane synaps i sąsiednich Boutons kontroli.

Protocol

Komórki: Rat (lub myszy) pierwotne neuronów hipokampa kultur (14-28 dni in vitro).

Stymulacja: elektryczne, dostarczane za pomocą dwóch elektrod platynowych, 70-90 mV

Mikroskopia: 60x obiektyw olej na odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym CCD.

Oprogramowanie: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, Kalifornia)

Zobacz dodatkowe strony metod dalsze szczegóły

  1. Warm-HEPES soli buforowanej (HBS) do temperatury pokojowej. Dodaj antagonistów receptorów glutaminianu APV (50 mM stężenie końcowe) i CNQX (10 mM wersja ostateczna). Każdy FM eksperyment wymaga zazwyczaj 20-30 ml HBS. Do pracy stężeniu 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes) i rozcieńczyć roztwór 1:1000 w HBS (z antagonistami dodane). Dodać 2 ml FM ciekłym dla każdego doświadczenia. Pokrywa rozwiązanie folią, aby zapobiec ekspozycji na światło.

  2. Zamontuj szkiełka zawierające neuronów na komory elektrody. Sprawdź, że media w komorze jest na poziomie górnej części komory i całkowicie pokrywa elektrod. Usuń nadmiar roztworu z dna szkiełka. Dodaj olej do obiektywu (jeśli używasz obiektywu z oliwek).

  3. Ustaw aparat perfuzji. Pierwszy spłukać kilka ml każdego następnego w podanej kolejności (niech każdy przepływ dokładnie przed dodaniem następnego): woda, etanol, woda, następnie HBS. Następnie dodać HBS (zapisać kilka ml, aby dodać ręcznie w przyszłości kroków) i zamknij perfuzji. Ustaw gniazdka perfuzji i ssania po przeciwnych stronach na brzegach szkiełka. Dobrze jest, gdy gniazda perfuzji dochodzi do komory, gdzie jako ssania powinno opierać się na samej górze. Podczas dodawania HBS (przez perfuzji lub ręcznie), otwórz ssanie i dostosowanie ich położenia tak, że utrzymuje mediów na odpowiednim poziomie, tylko w pełni pokrycie elektrod.

  4. Spójrz na obszar na szkiełko chcesz obraz i spróbuj mniej więcej doprowadzić go w polu ostrości. Optymalnych obszarów zawierają wiele synaps, ale nie powinno być tak gęsta, tak, że poszczególne procesy się nie do odróżnienia. Nie powinno być-to-minimal ciał komórek, błon zewnętrznych (takich jak kępy astrocyty), lub innych materiałów niespecyficzne (np. lint). Barwnik FM może niespecyficznie przestrzeganie tych.

  5. Użyj "WG" kostka filtr (który podnieca się zielone światło i zbiera czerwone do dalekiej czerwieni emisji). Ustaw SlideView "Ustawienia przechwytywania", aby dostarczyć 900 AP na 10Hz na początek zdjęcia 0 (zwykle 300 do 900 punktów dostępowych wykorzystywane są do tego bodźca ładowania). W oknie obrazu wybierz "fluo-vis-czerwone" ustawienia filtra i zmiana czasu ekspozycji do 100 ms. Wyłącz wszystkie wcześniejsze ustawienia timelapse. Nie należy stosować żadnych zdjęć, dopóki nie są gotowe do rozpoczęcia stymulacji.

  6. Upewnij się, że ssanie jest / open. Szybko dodać FM ciekłym (2 ml) do komory na drugi koniec ssania. Natychmiast naciśnij OK w oknie obrazu zrobić zdjęcie i rozpocząć stymulację. Odczekaj 30-45 sekund po stymulacji, a następnie szybko wypłukać FM, dodając ~ 2 ml HBS (mogę to zrobić ręcznie za pomocą pipety, ale może być również dokonane przez perfuzji).

  7. Umyć FM z HBS przez perfuzji na ~ 10 minut. Szybkość przepływu powinna być 1-1,5 ml / min. Podczas tego etapu umyć, zmienić preferencje stymulacji tak, że początek stymulacji rozpoczyna @ obrazu 10 (zwykle 900 do 1200 punktów przy 10 Hz są wykorzystywane do tego bodźca odbarwiania). Około 7 min do mycia, sprawdź preferencje (początek bodźca zdjęcie 10). Teraz przy małym oknie skupić się wybrać i skupić subregionu. Sprawdź, czy ustawienia stymulacji zostały zmienione przed przejściem do następnego kroku. Weź jeden obraz, czy umyć jest kompletny (poszczególnych synaps powinny być wyraźnie punctated). Jeśli nie, zwiększenie przepływu dodatkowe 0.5mL/min i czekać kolejne 2 minuty.

  8. Po zakończeniu mycia, ustawić czas ekspozycji należy jeszcze uzyskać dobry, jasny sygnał (zwykle pomiędzy 50-100 ms. Ekspozycji razy powinna być zminimalizowana ze względu na szybki fotochemiczną FM). Następnie ustaw preferencje timelapse wziąć 38 zdjęć co 5 sekund. Sprawdź perfuzji, aby nie wystarczy HBS przez kolejne 5 minut, i pozostawić perfuzji płynące. Początek timelapse rozpocząć odbarwiania.

  9. Po Odbarwiać, zmienić ustawienia stymulacji dostarczyć 1200 AP @ 10Hz (zwykle 1200 do 2000 punktów są wykorzystywane do tego ostatniego kroku) na zdjęcia 0. Wyłącz ustawienia timelapse i wziąć jeden obraz do rozpoczęcia stymulacji. Perfuzja powinny być nadal płynie Ten krok pomoże usunąć wszelkie pozostałe pęcherzykowej barwnika FM, w celu określenia podstawowych / "całkowite zwolnić" fluorescencji. Po zakończeniu bodźców, wyłączyć ustawienia stymulacji, przybliżyć region w centrum uwagi. Zamknij perfuzji i ssania, A następnie dwóch ostatnich obrazów bazowych. Albo pojedynczych obrazów lub Z-stack zdjęć (0,5 mikrometrów kroków) mogą zostać podjęte. Z-stosy są przydatne w przypadku nastąpiła zmiana w płaszczyźnie ostrości podczas eksperymentu.

  10. FM eksperyment jest wykonywana. Jeśli od razu robi więcej eksperymentów, soczewki i komory powinny być oczyszczone każdej próby, ale aparat perfuzji nie musi być czyszczone, aż po końcowy eksperymentu. Wypłukać urządzenie całkowicie wodą, a następnie etanolu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

W 300 akcji potencjałów (AP) jest wystarczające do wywołania co najmniej jedną rundę recyklingu pęcherzyk, załadunku bodziec do 300 punktów lub więcej, jest często stosowany do oznaczania puli recyklingu pęcherzyków. Choć bardziej intensywne bodźce załadunku, takich jak 900 punktów, może pozwolić nominalnej liczby dodatkowych pęcherzyków być znakowane, to także zwiększa ilość czasu barwnika może zamieścić w zewnątrzkomórkowej błony, co prowadzi do barwienia niespecyficzne. Znalazłem płukaniem być krytyczny dla zapewnienia właściwego odbarwiania. Ważne jest, aby perfuzji z przepływu od 1 do 1,5 ml na minutę, zazwyczaj dla 10 + 2 min. Jeden obraz może być podjęte ~ 7 minut do prania w celu monitorowania rozmiarów barwnika usunięcia. Jeśli to konieczne, natężenia przepływu i lub czas prania mogą być nieco wyższe. Dla naszych eksperymentów było niepożądane umyć, aby przejść więcej niż 10-12 minut, ponieważ zwiększa to prawdopodobieństwo utraty pęcherzyków znakowania poprzez spontaniczne imprezy egzocytozy, które mogą występować nawet wtedy, gdy komórka jest w spoczynku. Dla kroku odbarwiania, 900 do 1200 punktów były podawane do uwolnienia wszystkich znakowanych pęcherzyków. Dodatkowo kolejne 1200 do 2000 punktów były często stosowane w celu uzyskania wartości początkowej z "zwolnić fluorescencji", używany do normalizacji danych odbarwiania.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APV Sigma-Aldrich A5282
FM 4-64 Molecular Probes, Life Technologies T-3166
CNQX disodium salt Sigma-Aldrich C-239

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).

Comments

4 Comments

  1. The data you can see on the screen look af if you see a lot of photobleaching. Is this true?
    How do you correct for this?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 20, 2008 - 2:20 PM
  2. As in all fluorescence imaging experiments, bleaching can be corrected for in several ways.
    First, we use a sequence of frames where no stimulation was applied to obtain the bleaching rate
    (make sure to subtract a background region from all the frames). We then fit an exponential
    to this control background-subtracted data.
    Bleach(i) = Bleach(0)*exp(-i/tau) Then, we go back to the original data (minus the background) and apply the exponential correction.  F_corrected(i) = F(i)/exp(-i/tau)

    There are many descriptions of bleach correction on the web (just google).
    A nice description of bleach correction was recently described in:
    http://www.jneurosci.org/cgi/content/full/²5/19/4766/DC1 (see second supplementary material)
    A technical article on general calibration can be found in Journal of Microscopy, ²16:15-²4 (²004)
     

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 25, 2008 - 10:49 AM
  3. Thanks for this nice protocol.
    I started working with this technique and found your video really helpful.
    One question i would like to ask is related to the reproducability of this kind of experiments. Can you do repeated loading / unloadings on the same set of synapses?

    E.g., in my first experiments i use 600Ap/²0Hz stimuli for loading and destaining of the synapses, respectively. Image acquisation is done with with 1 Hz and a total of 70 images (²0 images before/after stimulation).

    While i get nice punctae with corresponding destaining curves in the first loading/unloading cycle, i found it vitually impossible to do a second round of stimulations at the same set of synapses. After the second loading the whole neurites become very bright, no punctae are identifiable and there is also no clear destaining, apart of photo bleaching.

    Can it be that the dye is damaging the synapses? (I use neutral density filters with ~5% transmission and select the exposure times as short as possible).

    Any comment or help on this is highly appreciated!

    Best,

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 17, 2009 - 6:12 AM
  4. Paul,

    It is not uncommon to have difficulty for repeated staining. It is often related to one of two things:

    (i) Too much background: it is possible that you are ending up with too much surface stain with repeated loading and you are swamping the actual intravesicular signal. You can test this by skipping the labeling step in the first round - just stimulate as many times to mimic stainign and destaining, but don't add FM dye. Then, try the second round staining.

    (ii) The preparation becoming unhealthy either due to excessive electrical stimulation or phototoxicity. You can test this by skipping stimulation the first round and just have dye present for the same time, wash it out. Then, wait and do the second round as usual. To test phototoxicity, you can do staining and destaining in the first round, but just don't image at all. Then, start imaging only for the second staining.

    In the end, I am afraid that you may have to try several combinations of things.

    Best,

    -venki murthy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 12:31 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics