ES细胞源性神经上皮细胞培养

Biology

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Summary

从胚胎干细胞(ES)细胞基质细胞衍生诱导活性(SDIA)上皮前体的推导。

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Karki, S., Pruszak, J., Isacson, O., Sonntag, K. C. ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures. J. Vis. Exp. (1), e118, doi:10.3791/118 (2006).

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Abstract

胚胎干细胞有潜力分化成所有胚层,这使得他们的新疗法的发展有吸引力的工具细胞。在一般情况下,ES细胞的分化如下的概念,首先生成不成熟的祖细胞,然后就可以繁殖成成熟的细胞表型分化。这也适用于ES细胞源性神经元的神经细胞的发展,其中以下两个主要步骤:首先,推导和扩大,不成熟的神经上皮前体和第二,其分化为成熟的神经细胞。从ES细胞产生的神经前体细胞胚体(EB)的形成,从而揭示了所有胚层,包括神经外胚层细胞的分化是基于一个共同的方法。另一种更有效的方法诱导上皮细胞的发育,使用基质细胞衍生诱导活性(SDIA),可实现与颅骨骨骨髓来源的基质细胞(1)共培养的ES细胞。两个EB形成和SDIA,揭示发展的莲座状结构,这被认为是类似于神经管和/或神经嵴祖。可以分离出神经前体,扩大和进一步分化成特定的神经元和神经胶质细胞,使用定义的文化条件。在这里,我们描述的一代在与基质细胞MS5(2-5)共培养的实验和隔离等花环。

Protocol

第1步

  1. 板丝裂霉素C ggrowth抑制(10微克/毫升为2.5小时)MS5细胞明胶包30分钟(0.01%)6孔板中的α- MEM媒体的密度在70,000 /平方厘米。
  2. 当细胞附着并已经形成了单层(过夜增长),切换至SRM。
  3. 手动隔离ES细胞克隆胚胎干细胞的使用注射器文化与27 ½ G针。
  4. 1毫升的蓝色提示和低密度板MS5细胞(通常为2-3%菌落6孔板)仔细Tritrurate殖民地。

注:胚胎干细胞也可以从使用胶原酶或胰蛋白酶的酶传播

第2步

  1. MS5馈线的ES细胞成长为14-21天,直到花环含菌落形成。


注:更改媒体经常。通常是在殖民地和300-500纳克/毫升Noggin被添加到SRM(3)如果他们的形成,可大大提高外缘的花环在一些分化协议,SRM可以用N2媒体交换,并辅以增长或其他因素,以促进细胞的规范(2-5 )。

第3步

  1. 隔离和花环半挑选了27 G针,在显微镜下。

注意:避免削减和采摘MS5基质细胞。如果殖民地玫瑰花包装,也可以隔离整个殖民地。


第4步

  1. 吸集群的花环,tritrurate 1毫升的蓝色提示,并在聚L -鸟氨酸(0.001%)和纤维连接蛋白(1微克/毫升)或层粘连蛋白(1微克/毫升)涂井板他们仔细N2 - 媒体通常辅以碱性成纤维细胞生长因子(20毫微克/毫升)。花环将改革和扩大。

注意:要提高细胞的存活,可在水滴的小群,以增加细胞密度。这一步也可以修改,补充额外的增长或其他因素,以促进细胞的规范(2-5)的氮气介质。

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Discussion

此协议表明,在生成和隔离上皮细胞从人类胚胎干细胞使用SDIA的不同步骤。这种方法的应用是多方面的,在许多协议,并已用于生产特定的神经元(如1,2,5-9)。花环被认为是像神经管细胞与前表型(2,5,10),还含有神经嵴祖细胞(11,12)。此外,他们还保留一定程度的可塑性,因为它们可以在规定的培养条件下的具体因素的图案。因此,SDIA源性神经前体细胞可以引起多种细胞类型,从中央和外周神经系统,使他们一个有用的工具,不同的神经细胞在胚胎干细胞分化范式人口的推导。

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
L-Glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030
alpha-MEM GIBCO, by Life Technologies 12571
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
Knockout-DMEM GIBCO, by Life Technologies 10829
Knockout serum replacement GIBCO, by Life Technologies 10828
MEM nonessential amino acid solution GIBCO, by Life Technologies 12383
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11330
N2-A supplement Stem Cell Technologies 07152
Mitomycin-C Sigma-Aldrich M0503
Gelatine type-A Sigma-Aldrich G1890
poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957 0.01% solution
Laminin Sigma-Aldrich L-2020
Fibronectin Sigma-Aldrich F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF) Invitrogen 13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle BD Biosciences 309623
N2-A media medium DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM) medium Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media medium α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5 cell line stromal cells
Microscope
6-well Plates for tissue culture

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References

  1. Forthcoming.

Comments

2 Comments

  1. Where can we get MS5 stromal cell line?

    Sergey Akimov, JHU SOM

    Reply
    Posted by: Sergey A.
    June 24, 2010 - 12:00 PM
  2. Just now noticed your comment. I believe the easiest way to obtain MS5 cells is via DSMZ - (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures; http://www.dsmz.de). The MS5 line is internal DSMZ no."ACC 441".

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 27, 2011 - 8:32 AM

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