Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu videoda, biz gelişmekte olan omurgalı beyin konfokal mikroskobu ile tek bir hücre çözünürlükte canlı zebrafish embriyolar analiz edildiği bir yöntem gösteriyor. Bu, tek hücreli zebrafish embriyo enjekte ve daha sonra gelişmekte olan beyin montaj ve görüntü hangi yöntemi içerir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217, doi:10.3791/1217 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bu video, laboratuarımızda, gelişmekte olan zebrafish beyin (Gutzman ve ark, 2008) viraj ve katlama için gerekli hücre şekli değişiklikleri ve düzenlenmeleri analiz etmek için geliştirdiği yöntem göstermektedir. Böyle bir analiz, omurgalı beynin 3 boyutlu yapısının gelişimi için gerekli olan temel hücre biyolojisi yeni bir anlayış tanıyor ve nöral tüp morfolojilerinden çalışma yeteneğini önemli ölçüde artırır. Embriyonik zebrafish beyin 18 saat sonra döllenme (hpf) başlayarak neuroepithelium şişirmek içinde ventriküller olarak şekillenir. 24 hpf, nöral tüp morfolojilerinden ilk adımları tamamlamalısınız. Burada anlatılan yöntemi kullanarak, bir hücre aşamada embriyo mRNA kodlama membran hedefli yeşil flüoresan protein (memGFP) ile enjekte edilir. Enjeksiyon ve inkübasyonu, embriyo, şimdi 18 ve 24 arasında hpf sonra, agaroz, ters, monte edilir ve konfokal mikroskobu ile görüntülenmiş. Özellikle, floresan görüntüleme için ideal bir sistem haline zebrafish embriyo şeffaftır. Analizler, orta beyin Beyin sınır ve arka beyin odaklanmış olmasına rağmen, bu yöntem 80-100 mikron derinliğe kadar zebrafish herhangi bir bölge analizi için genişletilmiş olabilir.

Protocol

1. Enjeksiyon için mRNA hazırlanması

  1. Bu prosedürde kullanılan mRNA bir plazmid kodlama CAAX eGFP (memGFP) mRNA transkripsiyonu. İlk plazmid ve ark, 2008 Gutzman göre linearize.
  2. Sonra mMessage mMachine kiti kullanılarak memGFP mRNA yazıya.
  3. Ortaya çıkan 1μg/μl için mRNA, kısım, ve mağaza sulandırmak -80 ° C
  4. Bir hücre aşamada embriyo şerit genişliği ile% 1 agaroz bir enjeksiyon kalıp hazırlayın.
  5. Enjeksiyon bir gün önce, kadın erkek ayıran çiftleşme kafesleri kurdu.
  6. Enjeksiyon gününde, enjeksiyon hazırlanmak için bir mikropipet çektirmenin kılcal iğneler kullanarak çekin.

2. MRNA enjekte

  1. Enjeksiyon gününde, buz üzerinde 1μg/μl memGFP mRNA bir kısım Çözülme.
  2. 200ng/μl bir final konsantrasyon mRNA 01:05 sulandırınız su ve buz üzerinde tutmak.
  3. 200ng/μl hazırlanan memGFP mRNA 1μl ile kılcal bir iğne yükleyin.
  4. Gazla çalışan bir mikroenjektör bağlı bir mikromanipülatör içine yerleştirin iğne yüklendi.
  5. 1nl enjeksiyon hacmi ayarlayın.
  6. Önceki günden itibaren çiftleşme kafesleri kadar yabani türü balıklar bölücüler çekin.
  7. Embriyoların kısa sürede belirtilen olarak toplayın. Orient onları mikromanipülatör uzak tarafında tek hücreli embriyo orta (Westerfield 1995) kapsamına agaroz enjeksiyon kalıp.
  8. Koryon enjekte edilir ve mRNA tek bir hücrenin içine doğrudan yatırıldığına dair sarısı. Deneme başına yaklaşık 50 embriyolar enjekte edilir. Hücre ikiye böldü enjekte etmeyin.
  9. , 28 ° C'de orta bir gecede embriyo inkübe embriyolar

3. Montaj ve Görüntüleme Embriyolar

  1. Embriyoların montaj ve görüntü için, ilgi bir zaman noktasında stereomikroskopta bir saat önce embriyoların forseps ile koryon çıkarın.
  2. 4 embriyolar kadar montaj için bir slayt hazırlayın.
    • Yaklaşık 1 cm çapında bir delik ile 2mm kalınlığında özel olarak tasarlanmış plastik slayt alt lamel mühür silikon vakum gres kullanın.
    • % 0.7 agaroz slayt delik doldurun ve yaklaşık 20 dakika veya sertleşmiş kadar bekletin
    • Agaroz katılaşmış sonra, her embriyo monte etmek için silindirik delik oluşturmak için 200μl pipet uçları kullanarak küçük bir fiş çıkarın.
  3. Diseksiyon mikroskobu altında agaroz dolu slayt embriyolar yerleştirin. Embriyoların uyutmak için tricaine 50μl (Westerfield, 1995) ekleyin.
  4. Altta yatan lamel karşı beyin ya da bölgeye ilgi agaroz silindirik delikler embriyolar konumuna forseps kullanın.
  5. Agaroz embriyolar silikon vakum gres ile güvenli başka bir lamel ile örtün.
  6. Görüntü kullanılarak embriyo ters bir lamba, floresan, lazer tarama veya disk konfokal mikroskop iplik. 63x ya da yüksek çözünürlüklü görüntüleri neuroepithelium içinde tek hücre toplamak için daha yüksek görüntü.
  7. Görüntüler LSM yazılım TIFF dosyaları olarak ihraç ve Photoshop kullanılarak analiz edilmektedir.

4. Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç

Şekil 1'de gösterildiği gibi, orta beyin ve arka beyin ventriküller arasında 24 hpf zebrafish neuroepithelium bir temsilcisi konfokal görüntü. Her hücre membran bağlı GFP ile etiketlenir.


Şekil 1. MemGFP-enjekte 24 hpf zebrafish embriyo konfokal görüntüleme Canlı.
(A), GFP tarafından açıklanan her hücre ile 24 hpf embriyo Neuroepithelium. Bölge görüntülü, orta beyin Beyin sınır oluşturan, orta beyin ve arka ventriküllerin (E, H, sırasıyla) ayırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu video, tek bir hücrenin zebrafish embriyolar içine mRNA enjeksiyon için bir yöntem ortaya koymaktadır. Burada, her bir hücre etiket için bir zar-hedefli GFP kodlayan mRNA kullanın. Daha sonra tek bir hücre çözünürlükte gelişmekte olan beyin nasıl montaj ve görüntü göstermektedir. Bu teknik bize hücre şekil değişikliği, orta beyin arka beyin sınır formasyonu (Gutzman ve ark, 2008) için gerekli olan bir roman türü, bazal daralma çalışmak için izin verdi. Benzer diğer olayların analiz omurgalı morfolojilerinden ve altta yatan hücre biyolojisi anlayışımızın önemli ölçüde genişletmek için bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Sive laboratuvarda ilk kez bu tekniği geliştirdi Dr. Jennifer Gutzman çok teşekkür ederiz. Lütfen plazmid kodlama CAAX-GFP mRNA sağlanan Dana-Farber Kanser Enstitüsü Boston, MA de JB Green teşekkür ederiz. Konfokal görüntüleme Whitehead WM Keck Vakfı Biyolojik Görüntüleme Tesisleri'nde gerçekleştirildi. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. EG, bir NSF öncesi doktora bursu ile desteklenmektedir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
SeaKem GTG agarose Reagent Lonza Inc. 50027
3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Capillary tubing Tool Frederick Haer and Co. 30-30-1 Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm
Silicone vacuum grease Reagent VWR international W0S717
Forceps Tool Fine Science Tools 11232-20 Dumont #5 Bio Inox
1-200 μl Pipette tips Tool USA Scientific, Inc. 111-0806 These are the correct size for 24 hpf embryos.
mMessage mMachine transcription kit Reagent Ambion AM1340 SP6 RNA polymerase
Zeiss LSM 510 scanning confocal Microscope Carl Zeiss, Inc.
Micromanipulator Tool Narishige International
Microinjector Tool Harvard Apparatus PLI-100
Micropipette puller Tool Sutter Instrument Co.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125, (974), 11-12 (2008).
  2. Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).

Comments

7 Comments

  1. Dear doctor: I think the method you development is very useful and easy to follow in our lab. However, I found that you use a specially designed ²mm-thick plastic slide with a hole approximately 1cm in diameter. Could you offer me the information about the company you bought this slide from? Or is this slide just a custom-made product? For I don't find the proper slide in our place. Looking forward for your reply. Best Regards, Li Ting

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2009 - 6:55 AM
  2. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:44 AM
  3. Li Ting, The plastic slides we use are custom made here at the machine shop at MIT.  The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. Good luck, Jen Gutzman  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 8:48 AM
  4. Li Ting,   As suggested by Dr. Jen Gutzman, also in our lab, our slides were custom-made by the MIT machine shop. The dimensions are the same as a regular microscope slide, but with a ² mm thickness and a single hole in the center that is approximately 1 cm in diameter. If you are having trouble getting them made, please contact me directly. We may be able to set up an order system through the machine shop here.   Best, Ellie Graeden

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 30, 2009 - 12:41 PM
  5. Dear
    Ellie Graeden & Hazel Sive
    First of all thanks for a nice publication entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". This publication is very useful for me as I am also working with zebrafish and currently I am pursuing my PhD at Center for Clinical Research in Neuropsychiatry,Graylands Hospital & Center of Excellence for Alzheimer's Disease Research & Care, Perth, Australia. I will be highly obliged if you could send me the full text of your publication. Do your university provide a short term training for some techniques related to Zebrafish Research, if yes please let me know, I am highly interested. I shall be thankful to you for your kind help
    Cheers
    Avdesh

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 22, 2009 - 8:22 PM
  6. Dear Dr. Sive,
    Could yuo please send me a your paper entitled " Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy". In our imaging lab, we have initiated establishing zebrafish models for oncology. Your publication wil be a very helpful for us. I will be thankful if you could send me your above-mentioned publication and otehr related publications too.
    With best regards,
    Nishigandha Naik

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 5, 2011 - 6:58 AM
  7. What is the little loop tool you're using to align the embryos? It looks like it might be easier to use than the tool I currently use. Is it just a blackhead remover?

    Reply
    Posted by: Brandon B.
    May 29, 2012 - 1:31 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics