Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218, doi:10.3791/1218 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Uygun embriyonik beyin gelişimi sırasında beyin ventrikül oluşumu normal beyin fonksiyonu için gereklidir. Beyin ventriküller, beyin omurilik sıvısı ile dolu, beynin içinde son derece korunmuş boşluklar vardır. Zebra balığı olarak, nöral tüp oluşumu sonrası, beyin ventrikül oluşumu ile sonuçlanan bir sıvı ile doldurur neuroepithelium daralması ve kıvrımlarının bir dizi uğrar. Ventrikül oluşum süreci, aynı zamanda meydana gelen nöroepitelyal şekil değişiklikleri anlamak için, beyin dokusu ile karşılaştırıldığında ventrikül alanı görselleştirmek için bir yol gerekiyordu. Ancak, şeffaf zebrafish embriyoların doğası zor ventrikül uzaydan gelen doku ayırt etmek için yapar. Bu nedenle, ventrikül alan floresan boya ile doldurulmuş ve aydınlık ve floresan mikroskobu ile görüntülü bir beyin ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi. Aydınlık ve floresan görüntüler daha sonra işlenmiş ve Photoshop bindirilmiş. Bu teknik, aydınlık görüntü neuroepithelium şekline göre, floresan boya ile ventrikül alanı görünüm için sağlar. Zebrafish Beyin ventrikül enjeksiyon erken larva aşamalardan 18 saat sonra döllenme ile istihdam edilebilirler. Biz yanı sıra beyin morfolojilerinden mutantlar (1-3) karakterize beyin ventrikül oluşumu ve morfolojilerinden çalışmalarımız yoğun bu tekniği kullanmıştır.

Protocol

Protokol

Bölüm 1: mikroenjeksiyon için hazırlık

  1. Sutter Aletleri iğne çektirmenin kullanarak kılcal iğneler çekerek enjeksiyon için hazırlayın.
  2. (Teksas Kırmızı Dextran'ın gibi) floresan boya ile iğne doldurun.
  3. Iğne mikromanipülatör ve mikroenjeksiyon cihazları monte edin.
  4. Eğimli bir ipucu oluşturmak için uygun büyüklükte iğne bir açıyla kesin.
  5. Damla boyutu ölçün ve petrol enjeksiyon başına 1-2nl arasında olduğunu kontrol edin.

Bölüm 2: embriyoların hazırlanması

  1. Embriyoların ilgi aşamasında daha 30 dakika önce enjekte edilir. Örneğin, 24 saat sonra döllenme (hpf) ventriküllerin çalışma, 23.5 hpf embriyolar enjekte edilir. Sahne Kimmel ve ark göre, embriyolar. (4).
  2. Stereomikroskop altında, forseps kullanarak embriyoların dikkatle koryon çıkarın.
  3. % 1 agaroz ile kaplı plastik tabak, plastik 1-200 ul pipet ucu ile agaroz delik karıştırmak. Forseps kullanarak deliklerden agaroz fişler dikkatlice çıkarın.
  4. Agaroz delikli çanak içine embriyolar embriyo medya aktarın.
  5. Medya ekle tricaine Westerfield (5) göre yapılan embriyoların uyutmak ve deneme sırasında hareket etmesini önlemek için.
  6. Deliğin içine embriyo kuyruk hafifçe aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve böylece enjeksiyon cihazı embriyonun arka tarafında yönlendirmek bu.

Bölüm 3: beyin ventrikül enjekte

  1. Beyin ventrikül enjekte etmek, iğne ucu, aynı alanda yüksek güç embriyo olarak böylece mikromanipülasyon kurulum düzenliyoruz.
  2. Dikkatlice aşağıdaki beyin dokusu vurmadan r0/r1 hingepoint sadece arka Beyin ince roofplate iğne koymak.
  3. Enjekte ventriküller tamamen doldurmak için yeterli boya. Embriyo aşamasına bağlı olarak, ventrikül boşluğu doldurmak için çeşitli enjeksiyonlar sürebilir.

Bölüm 4: Görüntüleme

  1. Kullanarak, temiz bir% 1 agaroz kaplı çanak çanak yeni delikler karıştırmak, fişlerin kaldırmak ve embriyoların uyutmak ve hareket etmesini önlemek için tricaine ekleyin.
  2. Ventrikül enjekte embriyo kuyruk, dorsal bir görüntü için delik ve konuma yerleştirin.
  3. Iletilen ışık kullanarak bir resim çekin.
  4. EMBRİYO VEYA MİKROSKOBU HAREKET çok kritik.
  5. Mikroskop ayarları değiştirin ve floresan ışığı ile bir görüntü almak.
  6. Iletilen ışık ve floresan ışığı ile yanal görüntüleri çekmek için embriyo konumlandırın.
  7. Photoshop görüntü işleme için TIFF dosyaları olarak kaydedin.

Bölüm 5: Görüntü İşleme

  1. Photoshop görüntüleri işlemek için, iletilen ışık ve floresan ışığı görüntüleri, aynı pozisyonda alınan aynı embriyo açın. Tüm ayarları her bir resim için aynı olduğundan emin olun.
  2. Floresan görüntü iletilen ışık görüntü üzerine sürükleyin ve onları tam olarak hizaya.
  3. Floresan görüntü seçildiğinde, "Resim", "Ayarlamalar, seçme" ve ardından "rengini değiştirme" ve beyaz siyah arka plan değiştirmek.
  4. Floresan görüntüler tekdüze renkli görünüyor kadar sağ "rengini değiştirin" penceresinde "bulanıklık" faktörü ayarlamak.
  5. "Katmanlar" penceresinde, bindirme görüntüleri izlemek için "Multiply" seçeneğini seçin. Ventrikül alan görüntü tam olarak iletilen ışık görüntü uyumlu olmalıdır.
  6. Bu dosya ve herhangi bir diğer görüntüler için tekrar kaydedin.

Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç

Yanlış enjeksiyon görüntülerin bir örnek EH içinde gösterilmiştir Uygun ventrikül enjeksiyon görüntüleri, 1 panelleri AD Şekil gösterilmektedir. Uygun enjeksiyonları, keskin kenarları olmayan diffüz boya var. Iğne çok uzak ventrikül içine yerleştirilir ve beyin dokusu vurur altında olduğunda oluşur yanlış enjeksiyon, ventrikül alanı dışında görünür boya ve yumurta sarısında neden olabilir.

Şekil 1

Şekil 1. 25 hpf vahşi tip embriyoların ventrikül enjeksiyonları Doğru enjeksiyon yöntemi (AD) ve (EH) yanlış enjeksiyon yöntemi örnek olarak gösterilmiştir. (A, E) Dorsal aydınlık görüntüleri (B, F) ve floresan ve aydınlık görüntülerin gösterildiği hem doğru ve yanlış enjeksiyon yöntemleri için kaplama (C, G) ilgili floresan görüntüler. Oklar, yanlış bir ventrikül enjeksiyon ("Sorun Giderme" bölümüne bakın) nedeniyle beyin ventrikül mekanın ötesinde boya gitti bölgelerde gösterir. Anterior tüm resimlerin sol.

Sorun Giderme:

Sorun Neden Çare
Iğne ile embriyo Ezici. Iğne çok künt veya ucu çok büyük. Yeni bir iğne ile başlayın ve bu kadar geri bozmazlar. Konik sizin iğne gibi keskin bir şırınga iğnesi yapmak.
Boya (bkz. Şekil 1E-H), embriyo ve yumurta sarısı boyunca. İğne doku geçti ve ventrikül boşluk kalmadı. Iğne yeteri kadar keskin olmayabilir, ponksiyon hızını kontrol etmek mümkün değildir.
Boya önbeyin çok zayıf ya da değildir. Enjeksiyon için yeterince yüksek bir basınç kullanmayın, ya da iğne kadar boya enjekte edildiğinde önbeyin ulaşmak için yeterli ön değildi. Enjeksiyon basıncı artırın ya da enjeksiyon sırasında iğne biraz daha ön yerleştirin. Daha ayrıntılı önbeyin gerekli ise orta beyin arka beyin sınır boyunca iğne koyabilirsiniz. Ayrıca, sadece ileri görüntüleme önce diffüz boya için biraz bekleyebilir.
Fluoresan görüntüler Photoshop renk değişiminden sonra kenarlarında koyu. Renk değiştirme penceresinde "bulanıklık" ayarını değiştirmek için unuttum. "Bulanık" renk değiştirme penceresi doğru şekilde hareket ettirin.
Iğne Beyin roofplate değil. Iğne düzgün kesilmiş değildir. Yeni bir iğne olun. Enjeksiyon yapıyoruz, mat gibi çeşitli iğneler gerekebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu video floresan boya (Texas-Kırmızı Dextran) Zebra balığı beyin ventriküller gelişmekte içine enjekte etmek için nasıl gösterilmektedir. Bu yöntem beynin ventrikül alanı çevreleyen neuroepithelium aksine görselleştirmek için kullanılan ve ventrikül alanı şekline yanı sıra çevredeki beyin dokusu şeklini belirlemek için son derece yararlı. Bu zaman içinde canlı embriyo beyin ventrikül oluşumu ve beyin morfolojilerinden süreci daha iyi anlamak için bize izin verir. Bu teknik, beyin ventrikül oluşumu kusurları okuyan ve ilk karakterizasyonu ve beyin morfolojilerinden mutantlar çalışma için mükemmel bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar, laboratuvar bu tekniği geliştirdi Laura Anne Lowery teşekkür etmek istiyorum. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. Jennifer Gutzman CSBi / Merck, doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Forceps Tool Fine Science Tools 11252-20
Capillary Tubes (needles) Tools Frederick Haer and Co. 30-30-1
Agarose-Coated dishes Tools Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) Agarose (50027) Dishes (430166) Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting
Dissecting Microscope Microscope Carl Zeiss, Inc.
Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software Tools
1-200 μ pipette tips Tools USA Scientific, Inc. 1111-0806 These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly.
Photoshop Image Analysis Adobe
Embryo Loop Tools Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax.
Microinjector Tools Harvard Apparatus PL1-100
Needle Puller Tools Sutter Instrument Co. Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70).
Micromanipulator Tools Narishige International
Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW Reagent Molecular Probes, Life Technologies D1830 Other Molecular weights are available if desired.
Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) Reagent Sigma-Aldrich A-5040
Embryo Media Reagent According to Westerfield (5)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
  2. Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
  3. Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
  4. Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  5. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. University of Oregon Press. (1995).

Comments

4 Comments

  1. What program was used for pulling the injection needles using the Sutter Instruments needle puller?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 16, 2010 - 6:10 PM
  2. We use the following settings for our Sutter Needle Puller
    HEAT:785, PULL:70, VEL:40, TIME:70
    Good Luck!

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 18, 2010 - 6:29 PM
  3. Hi, may I ask that what's the usual death rate of the injection procedure itself (is the death rate like the normal microinjection at one cell stage?) And how many embryos do you usually inject for phenotypic analysis? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 30, 2010 - 4:57 AM
  4. Hi, may I ask that how do you make sure that the amount of reagent you injected is consistant? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 30, 2011 - 4:40 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics